研究背景:骨肉瘤(Osteosarcoma)是当前阶段临床上较为常见的一种恶性肿瘤,在年轻群体中较为常见,从本质上来说是一种以间叶组织为主要来源的恶性肿瘤,发病部位常见于股骨远端和胫骨近端,恶性程度较高,预后较差。在临床上常见高复发率、高致残率以及肺转移较早等诸多特征。放射治疗以及截肢是1970年之前该症最为主要的治疗方法,肺癌转移率非常高,5年生存率不足20%。随着手术切除治疗方案的广泛应用,以及多药联合化疗的大规模推广,该症的5年生存率总体水平提升非常明显。但是我们必须认识到,虽然化疗在该症的临床治疗过程中已经发挥了可喜的作用,并得到了更为广泛的关注和重视,但是整体化疗有效率始终限制在60%上下。所以我们有理由认为,当前阶段骨肉瘤临床治疗正处于一个新的发展阶段,只有真正意义上的找寻到其标志物,才能有效的对其生物学特征和预后做出针对性的判断。除此之外,临床治疗有效分子靶向也同样是今后研究的主流方向,值得我们给予应有的关注和重视。含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白2(epidermal growth factor-containing fibulin-likeextracellular matrix protein 2,EFEMP2,在部分文献资料中也同样被又称fibulin-4,MBP1,UPH1),是fibulin糖蛋白家族的成员。Fibulin是新发现的一种ECM蛋白家族,目前包含有7个成员,即fibulin-1,-2,-3,-4,-5,-6和-7。临床上发现其功能主要包括促进相关组织的形成和稳定。现有研究成果证明,Fibulin-4广泛分布于人体组织,并直接和细胞外基质弹性纤维、基膜等重要组织之间有着紧密的内在联系,对于细胞外基质结构的稳定有着不容忽视的重要作用,也同样是研究中的重点和难点所在。目前研究发现fibulin家族成员参与调解细胞生长、形态以及运动的一系列过程,并在临床数据统计中表现出和肿瘤因子的显著关联。卵巢癌和乳腺癌中均发现该因子的高水平表达,并且也有研究成果认为Fibulin-1在雌激素的协同作用下起到促进肿瘤发展的作用。但是我们也同样应认识到,该因子在肝癌、胃癌和前列腺癌症中却通过抑制肿瘤血管的发展而起到了抑制作用。Fibulin-2作为抑癌基因,在肝癌和乳腺癌中抑制肿瘤细胞生长、侵袭,同时抑制血管生成。Fibulin-3在胰腺癌、宫颈癌和神经胶质瘤中高表达,促进肿瘤的发生发展。但在鼻咽癌、乳腺癌和多形性胶质细胞瘤中,Fibulin-3却呈现降表达,并且抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。Fibulin-5对癌症的抑制作用得到了学术界的广泛认可。在结构上来说,Fibulin-3,-4,-5有着非常明显的一致性,并且都可以通过和钙离子的结合而生成EGF-like区域的功能。现阶段,尚未有较多的研究成果阐释骨肉瘤和fibulin-4的关系,相关研究也同样尚处于起步阶段,相关文章比较少。Fibulin-4基因位于11q13染色体,11q13染色体末端部分的基因在很多肿瘤的发生中发挥致癌基因的作用,包括CCND1、EMS1、FGF3、FGF4和FOSL1。另外11q13染色体在肿瘤发生中也比较容易发生染色体易位和重排。因此,fibulin-4基因可能在肿瘤发生中发挥重要作用。Gallagher等发现fibulin-4在结肠肿瘤中表达增强,似乎验证了 fibulin-4致癌基因的假说。但Wlazlinski在研究中却发现fibulin-4在前列腺癌中呈现降表达。因此,我们猜测Fibulin-4在肿瘤发生发展中的作用可能存在组织特异性,不同的肿瘤微环境决定着基因的不同功能。总之,fibulin-4在肿瘤发生发展中的作用需要我们进一步的研究,在各种肿瘤中的作用可能不尽相同,在骨肉瘤的研究中,目前尚未发现关于fibulin-4的报道。综上所述,EFEMP2在多种肿瘤发挥着不同的功能,它在肿瘤中的表达关系到肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移和血管生成,目前为止对其在骨肉瘤发生发展的作用尚不清楚。本研究拟观测EFEMP2对骨肉瘤细胞生物学行为的影响、其潜在的关联性和可能的分子机制,为骨肉瘤的检测和治疗提供新策略。研究目的:1.探讨EFEMP2在骨肉瘤组织中的表达,与患者预后的相关性,及其临床意义;2.探讨EFEMP2对骨肉瘤侵袭、迁移能力的影响;3.探讨EFEMP2在骨肉瘤细胞中对上皮间充质转化的影响;4.探讨EFEMP2影响骨肉瘤细胞侵袭和迁移的相关信号通路。研究材料和方法:一、EFEMP2在骨肉瘤细胞生物学行为中的表达及相关性研究1.免疫组织化学选取自2005年至2015年间收集自山东大学齐鲁医院和山东省立医院骨科就诊的骨肉瘤病例石蜡组织标本共计160例,骨纤维结构不良标本60例,瘤旁正常组织40例,所有骨肉瘤病例均无术前的放射及化学治疗,常规随访。免疫组织化学检测的石蜡包埋切片首先在二甲苯中脱蜡,并在乙醇中再水化,然后在添入0.01M柠檬酸盐的PH为6.0缓冲液的高压锅内恢复;当达到压力时,切片在高压锅内孵化3分钟。免疫细胞化学中,细胞被接种于盖有载玻片的含有75%-80%混合液的培养皿中,24小时后收集盖玻片,PBS清洗三次,在 95%的乙醇中处理 30 分钟。按照 Streptavidin-Peroxidase Detection Kit(ZSGB-BIO),接下来的步骤对于免疫组织化学检测和免疫细胞化学检测是相同的。2.软琼脂克隆形成实验用20%FBS培养基1.5ml与1.2%琼脂1.5ml混合加载至3.5cm培养皿,并凝固为底层;0.7%琼脂1.5ml混合20%FBS培养基1.5ml及200μl(MG63、U-2OS及hFOB)细胞悬液(含600个细胞)立即加入培养皿上层;所有的培养皿在37℃、5%CO2饱和适度下孵育2周,实验每个重复一式三份。在倒置显微镜(Nikon Eclipse)下,培养皿分为各个象限,对每个象限内的直径2mm以上的集落进行计数和平均数;所有数据用均数±标准误表示。3.细胞侵袭实验被覆 PVPF 的 Boyden 小室(BD Biosciences,Bedford,MA)加入 50 μl 1:3 滴度的无血清Matrigel胶。上室内加入200 μl(含2 × 105个细胞)的(MG63、U-20S及hFOB)细胞悬液,下室内加入600 μl无血清的上清NIH3T3细胞作为趋化因子,Boyden小室在37℃下孵育24小时。移除上表面基膜内非侵袭性细胞,下表面细胞以4%多聚甲醛固定,苏木精伊红染色,于倒置显微镜下随机5个高倍视野内计数。每个重复一式三份,所有数据用均数±标准误表示。4.细胞迁移实验细胞迁移实验同时按照上述步骤进行,不需Matrigel基膜,只孵育12小时。每个重复一式三份,所有数据用均数±标准误表示。5.免疫细胞化学实验各细胞被接种于盖有载玻片的含有75%-80%混合液的培养皿中,24小时后收集盖玻片,PBS清洗三次,在95%的乙醇中处理30分钟;余步骤同免疫组织化学实验。二、EFEMP2在骨肉瘤细胞侵袭及转移能力的研究1.单细胞克隆技术分离MG63细胞亚克隆株取对数期生长的MG63细胞稀释至10个/ml,并以0.1ml/孔接种于96孔板,尽可能使之每孔内一个细胞,添加培养液至0.2ml/孔,在37℃、5%CO2孵化箱一周后,收集生长良好的每个孔内的单克隆细胞,依次移至24孔和6孔培养板,最后移至培养瓶中扩大培养。在细胞电泳设备(DY-100)中,分别测定各亚克隆细胞的迁移率。最终获得31株单克隆细胞亚系,编号为 MG63-1～MG63-31。2.细胞电泳率的测定取克隆的31株细胞,常规培养至汇合状态,对其进行离心处理后去除上清液,通过滴加1%蔗糖溶液重悬获得单细胞悬液,利用光电显微镜对其活细胞数量进行统计,调整细胞密度至1 ×106/ml,加入细胞电泳仪。计数12-16个瘤细胞/株,在电场中自动泳动250μm正向和反向各一次所需时间,根据公式计算细胞电泳速度。根据电泳结果,MG63-1细胞株速度最快,MG63-31细胞株最慢。3.生长曲线各个细胞亚系收集于对数增长期,接种于24孔板(1×104个细胞/孔),在37℃、5%CO2孵育;每日在三个孔内加入胰酶消化,收集活细胞,并计数和均数;细胞倍增时间按照patterson公式计算,连续7天按照细胞计数和均数标绘生长曲线。结果显示MG63-1克隆株的生长最快,MG63-31最慢。4.慢病毒转染pLVX-EFEMP2慢病毒载体和EFEMP2 shRNA慢病毒载体以及阴性对照,均由GeneChem Inc.获得。根据载体的说明,优先将病毒感染的靶细胞接种于24孔板,每孔细胞数0.5×105,于37℃、CO2孵化箱孵育24或48小时,至60-80%的细胞汇合;然后通过加入病毒库将细胞感染,多重感染指数(MOI)达到100。另外,也包括阴性对照的病毒构建转导孔。细胞在37℃、5%CO2条件下孵育整晚,转染混合物放置在正常培养基内,避免细胞毒作用。48小时后,细胞通过荧光显微镜检查进行评估;转染效率由蛋白免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应法和免疫细胞化学法确认。EFEMP2的siRNA序列是:sense 5 ’-CAGAUCCGUGCUGGAAACUCG-3’ 和 antisense 3 ’-AGUUUCCAGCACGGAUCUGAA-5’。阴性对照(杂乱次序;)是:sense 5’-AUCGACGAUCCCUAUUGGCGU-3’ 和 antisense 3’-GCCAAUAGGGAUCGUCGAUCU-5’。5.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)TRIzol(?)试剂(AmbionTM)用于从细胞及组织中分离总RNA,用TaqMan(?)反转录试剂(Applied Biosystems Inc.;Thermo Fisher Scientific,Inc.)反转录。实时定量PCR混合物25μl,包含12.5μl SYBR Green Mix(Power SYBR(?)Green PCR Master Mix,Applied Biosystems Inc.),0.2μl cDNA,1 μl引物对复合物(每个引物 5 pmol/μl),和 11.3 μl DNAse/RNAse-free H2O。实验反应在 ABI Prism SDS 7000(Applied Biosystems Inc.;Thermo Fisher Scientific,Inc.)中完成:50℃持续2分钟,1个周期;95℃持续10分钟,1个周期;95 ℃持续15秒->60 ℃持续30秒->72 ℃持续30秒,40个周期;72℃持续10分钟,1个周期。6.Western blot 实验各细胞分别裂解于包含1 mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)的(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液中。细胞裂解液中取40μg总蛋白,加载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳孔内,同时进行分子量标记;在100V下电泳1-2小时,转移至PVDF基膜,并由5%牛血清白蛋白阻滞。基膜与一抗)在4℃、1:1000稀释度下孵育整晚。经过TBST每5分钟清洗基膜三次,共轭二抗稀释1:1000滴度室温下孵育1小时。使用强化学荧光法测定(PierceTM ECL Western Blotting Substrate;Thermo Fisher Scientific,Inc.)。7.细胞迁移及侵袭实验同前。8.裸鼠移植瘤实验BALB/C-nu/nu裸鼠购自中国国家资源中心啮齿类动物实验室。每组5只,每只皮下接种5.0 ×106个细胞;裸鼠均放置在无菌设施内,每日监测肿瘤生长。每周,用游标卡尺测量肿瘤大小,用公式:V=长径×宽径2×0.25计算。2个月后,所有裸鼠处死,瘤体切开进行组织学检查,所有数据用均数±标准误表示。三、EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化在促进骨肉瘤侵袭及转移的作用及机制研究1.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验方法同前。2.Western blot 实验实验方法同前。统计学分析免疫组化检测数据使用X2检验。双侧t检验用于比较两组的均数比较,三组均数间的比较使用单边方差分析。Kaplan-Meier检验、秩和检验和生存曲线分析用于EFEMP2与骨肉瘤病例预后之间的相关性分析。所有数据使用SPSS13.0软件分析,以P<0.05(双侧)认为具有统计学差异。研究结果:1.EFEMP2在人骨肉瘤组织内表达我们发现在人骨肉瘤组织内EFEMP2蛋白高表达,而在大多数的正常组织内EFEMP2的免疫反应性很低;而且,EFEMP2高表达肯定与低分化类型和淋巴结转移相关。在qRT-PCR实验中,发现骨肉瘤组织中的EFEMP2 mRNA高表达与肿瘤的低分化和淋巴结转移同样具有相关性。利用Kaplan-Meier检验的生存曲线分析表明,骨肉瘤中EFEMP2高表达的病例的不良预后要高于低表达者。2.高侵袭及低侵袭亚克隆细胞株的建立使用单细胞克隆技术,从MG63细胞中亚克隆出31株;相对于MG63-31亚克隆细胞株的低迁移率(7.68 ± 0.13 μm/s),MG63-1亚克隆细胞株据有更高的迁移率(19.59 ±0.56μm/s),并表现出更高的增殖力和侵袭能力。在体内,高侵袭亚克隆组的皮下肿瘤形成率为100%,并伴有肿瘤的迅速生长;而低侵袭组的皮下肿瘤形成率只有大约50%,生长速度亦缓慢。MG63-1组的肿瘤体积为479.82 ± 34.31 mm3,要显著大于MG63-31组的瘤体体积(35.91 ± 3.73 mm3,p<0.01)。3.人骨肉瘤细胞系与正常成骨细胞系的不同增殖和侵袭力与正常成骨细胞系hFOB相比,人骨肉瘤细胞系U-20S和MG63表现出更强的增殖能力;在软琼脂克隆形成实验中,细胞系U-20S和MG63所形成的克隆数也显著的高于细胞系hFOB;在细胞迁移实验和Matrigel侵袭实验中,细胞系U-20S和MG63的迁移和侵入均数都高于细胞系hFOB。在两个骨肉瘤细胞系中,MG63组的增殖能力和侵袭力要强于U-20S组。4.EFEMP2在人骨肉瘤细胞系及其不同亚克隆细胞株中的表达相对于人骨肉瘤细胞系MG63和U-20S,EFEMP2在正常成骨细胞系hFOB中的表达非常弱;我们在MG63细胞系中检测到EFEMP2的强烈表达,并显示其具有很高的增殖能力,我们在比较不同亚克隆细胞株的侵袭能力时发现了相同的结果,EFEMP2在高侵袭亚克隆细胞株MG63-1中的表达显著高于MG63-31株。5.在慢病毒转染系统中识别EFEMP2表达的上调与下调进一步研究EFEMP2在骨肉瘤细胞增殖与侵袭中的潜在作用中,运用慢病毒转染技术,我们降低了 EFEMP2在高侵袭亚克隆细胞株MG63-1中表达,提高了它在低侵袭亚克隆细胞株MG63-1中的表达。病毒转染后,在mRNA和蛋白质水平,通过实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白电泳印记和免疫细胞化学法进行证实,指示转染效率。6.EFEMP2基因敲除和超表达在骨肉瘤细胞增值能力的作用在高侵袭亚克隆细胞株MG63-1中下调EFEMP2能显著的抑制细胞增殖能力,而在低侵袭亚克隆细胞株MG63-31中上调EFEMP2可以明显的促进细胞的增殖能力;在软琼脂形成实验中,EFEMP2沉默细胞的克隆形成率下降,而上调EFEMP2的低克隆细胞株的形成率增加;在未感染组和阴性对照组未发现显著差异。7.EFEMP2基因敲除和超表达在骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的作用EFEMP2基因敲除后可抑制骨肉瘤细胞侵袭和转移,EFEMP2 shRNA感染细胞的迁移和侵袭均数显著低于阴性对照组和未感染组(P<0.05);同时,EFEMP2超表达促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移,pLVX-EFEMP2感染细胞的迁移和侵袭均数显著高于阴性对照组和未感染组(P<0.05);在未感染组和阴性对照组未发现显著差异。8.EFEMP2基因敲除和超表达在移植瘤模型中瘤细胞生长的作用EFEMP2 shRNA感染细胞、pLVX-EFEMP2感染细胞、阴性对照MG63-1细胞和阴性对照MG63-31细胞分别单独的接种于5只裸鼠;成瘤率在阴性对照MG63-1组为100%,而在EFEMP2 shRNA感染组只有60%,并且EFEMP2 shRNA感染组的成瘤体积要显著小于阴性对照MG63-1组,显示EFEMP2基因敲除抑制裸鼠肿瘤形成,与此同时地,EFEMP2超表达促进裸鼠的肿瘤生长。pLVX-EFEMP2感染细胞组成瘤率为100%,而阴性对照MG63-31细胞组仅为40%,并且,pLVX-EFEMP2感染细胞组的平均瘤体体积显著高于阴性对照MG63-31细胞组。9.EFEMP2对EMT关键基因的作用结果显示,EFEMP2敲除通过增加E-cadherin的表达以及降低N-cadherin,vimentin,Snail,Slug,and Twist 的表达而显著的抑制 EMT;相反,EFEMP2 上调可以降低 E-cadherin 的表达及增加 N-cadherin,vimentin,Snail,Slug,and Twist的表达而引起EMT。10.EFEMP2在PI3K/AKT/mTOR信号通路中的作用研究结果显示,EFEMP2敲除可以减低PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平;相反,EFEMP2上调可以提高它们的磷酸化水平。利用PI3K/AKT/mTOR 抑制剂 LY294002(5,10,and 20 μmol/L)处理 pLVX-EFEMP2转染细胞48小时,我们发现同时被EFEMP2上调后激活的PI3K/AKT/mTOR通路和EMT仍然可被LY294002显著的抑制,并表现出浓度依赖性。结论:1.EFEMP2在骨肉瘤组织中呈阳性表达,并与不良预后正相关2.EFEMP2在体内外试验中均促进骨肉瘤细胞的侵袭及转移3.EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化