研究目的Wnt5a是Wnt蛋白家族重要成员之一,不仅与个体发育、细胞粘附、迁移、增殖、分化、极性和死亡等相关,甚至与肿瘤发生关系密切。目前研究发现,Wnt5a在肿瘤中既有增高表达又有下调表达,它既可能激活Wnt/β-catenin信号传导途径,又可能激活非经典Wnt5a/Ca²⁺信号传导途径,故Wnt5a既可能是癌基因,又可能是抑癌基因。关于Wnt5a在血液病中表达及其作用的研究鲜见报道,更罕见外源性Wnt5a对白血病细胞有何生物学效应的研究报道。为此,本研究首先检测了Wnt5a及β-catenin在一些血液病病例及白血病细胞株中的表达情况,在此基础上,以K562细胞为细胞模型,观察外源性Wnt5a是否激活非经典Wnt5a/Ca²⁺信号传导途径,并观察其生物学效应,以探讨Wnt5a在白血病发生中的作用和机制,为白血病的治疗寻求新的治疗靶点。研究方法1.应用RT-PCR方法检测31例各类血液病病例样本和3种白血病细胞株Wnt5a表达,并检测11例髓细胞白血病病例样本和3种白血病细胞株β-catenin的表达。2.应用HEK293细胞扩增带有标记基因GFP的重组腺病毒AdWnt5a和AdGFP,以AdWnt5a和AdGFP分别感染CHO细胞,制备Wnt5a和GFP条件培养液,以western blot鉴定条件培养液Wnt5a蛋白的表达。3.以荧光染料Fluo-3/AM预染K562细胞,以激光共聚焦显微镜分别观察Wnt5a和GFP条件培养液对K562细胞Ca²⁺内流的影响,观察外源性Wnt5a是否激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca²⁺信号传导途径。4.分别以Wnt5a和GFP条件培养液培养K562细胞1⁵ d,以RT-PCR、免疫细胞化学和western blot等方法观察K562细胞β-catenin和cyclin D1的表达变化,观察外源性Wnt5a与Wnt/β-catenin信号传导途径的作用关系。5.分别以Wnt5a和GFP条件培养液培养K562细胞1⁵ d,观察外源性Wnt5a对K562细胞的生物学效应:每天计数细胞数量,绘制生长曲线,观察外源性Wnt5a对细胞增殖的影响;以流式细胞仪分析细胞周期分布,观察外源性Wnt5a对细胞周期分布的影响;以DNA Ladder电泳和AO/EB染色法,观察外源性Wnt5a对细胞凋亡的影响;细胞以瑞氏染液染色,光镜下观察细胞形态学改变,并利用免疫细胞化学染色检测细胞表面分化抗原CD13、CD41、CD68和GlyA的表达变化,观察外源性Wnt5a对细胞分化的影响。实验结果1.Wnt5a在髓细胞白血病病例样本及K562、HL-60细胞中表达缺失,而β-catenin在多数髓细胞白血病病例样本及K562细胞和Jurkat细胞呈高表达。2.分别利用重组腺病毒AdWnt5a、AdGFP感染CHO细胞,成功制备Wnt5a及GFP条件培养液,经western blot鉴定Wnt5a条件培养液含Wnt5a蛋白,而GFP条件培养液无表达。3.GFP条件培养液不能促进K562细胞Ca²⁺内流,而Wnt5a条件培养液可促进K562细胞Ca²⁺内流,且这种作用可被Wnt5a抗体抑制。4.Wnt5a条件培养液培养不能下调K562细胞β-catenin mRNA的表达,但能下调K562细胞β-catenin及cyclin D1蛋白的表达。5.Wnt5a条件培养液对K562细胞的生物学效应有:细胞增殖明显受抑制;细胞周期分布G1期细胞比例增多,S期及G2期细胞比例减少;细胞形态出现了向成熟细胞分化的特征,细胞表面分化抗原CD13、CD41及GlyA表达变化不明显,CD68表达阳性率显著升高;细胞DNA Ladder电泳未出现明显梯形条带,激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡率无明显变化。研究结论1.Wnt5a表达缺失和β-catenin高表达可能是髓细胞白血病的发生相关因素。2.外源性Wnt5a可激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca²⁺信号传导途径,并在蛋白水平下调K562细胞β-catenin及cyclin D1表达,提示在K562细胞中,外源性Wnt5a可抑制Wnt/β-catenin信号传导途径。3.外源性Wnt5a可使K562细胞发生G1期阻滞,抑制K562细胞的增殖,诱导K562细胞向单核细胞分化,但无诱导K562细胞凋亡作用。