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目的:(1)运用贴壁法与流式细胞分选方法分离提纯人髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)。(2)从细胞形态、增殖特点、免疫免疫表型、三系分化等方面比较两种方法获得的髓核间充质干细胞的生物学活性。方法:收集腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织(Pfirrmann分级均为Ⅳ级),利用酶消化法分离细胞。分别采用两种方法分离提纯NPMSCs,一组细胞采用贴壁法培养,另一组通过流式细胞分选技术利用NPMSCs表面阳性标志物CD73、CD90、CD105获得NPMSCs。将两种方法获得的NPMSCs进行体外培养扩增,分别进行形态学观察,CCK-8检测增殖能力。向成骨、成脂、成软骨诱导分化,诱导28天后分别进行茜素红染色观察其成骨能力、油红O染色观察其成脂能力、甲苯胺蓝染色观察其成软骨能力,利用Imag J软件计算染色区域所占的面积百分比。比较两组NPMSCs在形态学,免疫表型以及增殖和分化能力的差异。结果:(1)流式细胞分选仪以PE-CD73、APC-CD90、V450-CD105作为表面阳性标志,分选出CD73+、CD90+、CD105+三阳性的髓核间充质干细胞,平均获得数为(3.53±0.78)×106个,其比例约(89.67±2.52)%。贴壁法获得的髓核间充质干细胞CD73、CD90、CD105的阳性表达率,分别为(89.79±2.40)%,(94.07±2.31)%,(90.49±1.63)%。(2)经酶消化后的原代细胞在接种后5-7h贴壁,原代细胞呈长短不一的短梭形,待细胞生长达80-90%融合时,可见旋涡状生长或者以组织块为中心的漩涡形成,排列整齐。流式细胞分选方法获得的髓核间充质干细胞在接种后4-6h观察到贴壁生长,主要以旋涡状生长为主,少见散在的单个贴壁生长细胞,12-15天细胞可达到80-90%融合。(3)在培养4h-1d,流式组NPMSCs的增殖活力明显低于贴壁组NPMSCs(P<0.05),第3天两组OD值无明显统计学差异(P>0.05)。在第5d-13d,流式组NPMSCs增殖能力明显高于贴壁组NPMSCs(P<0.05)。(4)流式组NPMSCs流式细胞仪免疫表型的检测结果显示,CD73的表达率为(98.55±0.35)%,CD90的表达率为(98.47±0.57)%,CD105的表达率为(98.20±1.24)%,表达率明显高于贴壁组NPMSCs。流式组NPMSCs造血干细胞标志物CD45、CD34及HLA-DR等的表达率均低于4%。(5)成骨诱导分化:两组NPMSCs经诱导28天后,显微镜下可见细胞内有黑色不透光区域,经茜素红染色后可见细胞表面存在大量红染的钙盐沉积,肉眼观可见流式组NPMSCs红染面积多于贴壁组NPMSCs,应用Imag J软件进行图像分析,测得流式组NPMSCs红染面积的比例明显高于贴壁组NPMSCs(P<0.05)。成脂诱导分化:两组NPMSCs经成脂诱导28天后,显微镜下观察可见细胞内有大小不等的光亮圆形脂滴形成,经油红“O”染色均可见片状或点状的红染脂滴空泡,应用Imag J软件进行图像分析,测得流式组NPMSCs红染面积的比例明显高于贴壁组NPMSCs(P<0.05)。成软骨诱导分化:两组NPMSCs经诱导28天后,均可见乳白色的软骨微球形成,甲苯胺蓝染色后两种细胞均可见明显蓝染的软骨细胞,Imag J软件分析发现流式组NPMSCs蓝染软骨细胞面积明显高于贴壁组NPMSCs(P<0.05)。结论:本实验利用流式细胞分选技术从人退变髓核组织中获得较高纯度的NPMSCs,并能进行后续培养扩增。与贴壁法获得的NPMSCs相比,流式分选的NPMSCs具有更强的增殖与分化能力。流式细胞分选方法为研究NPMSCs的生物学特性提供了可靠的细胞分离与纯化方法。流式组获得的NPMSCs能够贴壁生长、完成三系分化诱导,提供了人髓核组织中存在间充质干细胞的依据。