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背景：肝脏缺血／再灌注损伤(HI/RI)是肝移植术、肝切除等需要阻断肝脏血流的外科手术中常见的病理生理过程,严重影响手术效果和患者的预后。已有研究证明：氧自由基和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)过量生成、能量代谢障碍、钙超载、中性粒细胞浸润和线粒体功能障碍等机制均参与了肝脏缺血／再灌注损伤的病理生理过程。硫化氢(H2S)是气体信号分子家族一员,具有抗氧化、抗炎症和抗凋亡的作用。同时,H2S也是一种毒性气体,是细胞色素氧化酶的强抑制剂,能抑制电子传递和氧的利用导致细胞内缺氧。目前研究表明,H2S对肝脏I/R损伤具有保护作用,但其机制尚未完全明了。在肝脏I/R损伤中,H2S是否通过保护线粒体功能发挥拮抗作用,尚有一定争议性。本实验用H2S的供体硫氢化钠(NaHS)预处理大鼠肝I/R损伤,通过组织学观察、线粒体钙容纳力测定、线粒体凋亡通路相关蛋白检测来研究H2S预处理对肝脏I/R损伤的保护作用及可能机制。第一部分H2S预处理对肝脏缺血/再灌注损伤的保护作用通过组织学观察和氧化还原指标的测定明确H2S对肝脏I/R损伤的保护作用。研究方法：采用大鼠肝脏70%缺血模型,夹闭肝脏左中叶脉管系统,形成肝脏中叶和左叶缺血,缺血1h/再灌注24h。将Sprague Dawley (SD)大鼠随机分成4组：假手术组(Sham组)：只打开腹腔,不给予夹闭缺血；缺血再灌注组(I/R组)；物理性缺血预处理组(IPC组)：缺血1h前,给予一次短暂缺血(10min/次),中间开放血管10min；NaHS预处理组(NaHS组)：缺血前5min静脉给予外源性H2S供体NaHS。首先选取三个NaHS浓度(1μmol/kg,25μmol/kg,37.5μmol/kg),经过组织学观察,选出最适浓度。将各组肝脏组织进行HE染色和Tunel染色,光学显微镜下观察I/R后肝脏组织损伤变化和凋亡水平,对各组大鼠肝脏损伤程度和凋亡率进行评分。取新鲜的肝脏组织立即进行谷胱甘肽(glutathione, GSH)检测,观察NaHS预处理后肝脏组织中氧化指标的变化。结果：光学显微镜下观察三个浓度的NaHS预处理肝脏I/R损伤后的肝脏组织学变化,选取肝脏组织学损伤最小的NaHS浓度——25μmol/kg。观察苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色结果,NaHS组肝脏血窦区条索样结构保存相对完整,组织中无或仅有少量气球样变性,而I/R组肝脏组织正常细胞边界消失,可见大量细胞变性坏死,IPC组损伤程度介于I/R组和NaHS组之间。与I/R组相比,NaHS组Suzuki肝脏组织学评分显著下降(1.667±0.52VS2.667±0.52,P<0.05)。Tunel染色结果显示,与I/R组相比,NaHS组凋亡率显著下降(13.9%±0.045%VS38.6%±0.07%,P<0.05)。检测GSH含量结果显示,与I/R组相比,NaHS组肝脏组织中GSH含量显著升高(P<0.05)。结论：25μmol/kg NaHS预处理肝脏I/R损伤,肝脏损伤明显减轻,细胞凋亡显著下降,组织中GSH含量升高,提示H2S对肝脏I/R损伤的保护作用与其介导产生GSH,拮抗肝脏I/R后的氧化损伤有关。第二部分H2S预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用——线粒体机制研究实验一线粒体分离鉴定及线粒体钙容纳力检测鉴定差速离心法分离的线粒体纯度,检测大鼠肝脏I/R后肝脏组织中线粒体膜通透性。研究方法：SD大鼠随机分为4组(处理方法同第一部分)。各组大鼠缺血1h再灌注24h后,取新鲜肝脏中叶用差速离心法制备线粒体。固定线粒体悬液,应用透射电镜观察悬液中线粒体纯度。下一步,应用FlexStationⅡ荧光检测仪检测各组大鼠线粒体的钙容纳力,计算线粒体钙容纳力(mitochondria calcium capacity, CRC)值,以此判断线粒体的膜通透性。结果：经投射电镜鉴定,差速离心法分离大鼠肝脏组织线粒体纯度较高,形态基本正常,可以满足下一步实验的要求。经过FlexStationⅡ荧光检测仪检测的线粒体对外源性钙脉冲的承受力后,可见,1mg NaHS预处理组大鼠肝脏线粒体可以承受外源性钙脉冲(10μM CaCl2/min|约7次左右,而I/R组大鼠肝脏线粒体仅可承受3-4次左右。与I/R组相比,NaHS组CRC值极显著升高(198.63nmol/mg±24.86nmol/mg VS150.685nmol/mg±13.04nmol/mg, P<0.01).结论：差速离心法分离大鼠肝脏组织线粒体纯度较高。肝脏缺血1h/再灌注24h后,线粒体的钙容纳力下降,线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial membrane channel pore, MPTP)敏感性增加,线粒体功能受损。H2S预处理后,可以稳定肝脏I/R损伤后的线粒体膜电位,降低MPTP敏感性,减少线粒体肿胀,保护线粒体功能,保护肝脏细胞。实验二H2S预处理对肝脏缺血/再灌注损伤的保护作用机制——磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路研究研究H2S对肝脏I/R后细胞凋亡水平的影响,探讨其保护机制是否通过激活细胞内促生存通路——磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)通路发挥作用。研究方法：SD大鼠随机分为4组(处理方法同第一部分)。组织液氮速冻后提取蛋白,western blot法检测PI3K/Akt通路主要蛋白——Akt,磷酸化的Akt(phosphorylated Akt, p-Akt),B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma2, Bcl-2),活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3),细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)。结果：Western blot结果显示,与I/R组相比,NaHS预处理组Caspase3蛋白表达显著下降(P<0.05),IPC组Caspase3蛋白表达无明显差异；与I/R组相比,IPC组、NaHS组p-Akt蛋白表达显著上升(P<0.05),IPC组上升更为明显；与I/R组相比,IPC组、NaHS组Bcl-2蛋白表达量显著上升(P<0.05)；与I/R组相比,NaHS组细胞胞浆中CytC蛋白表达量显著下降(P<0.05)。结论：NaHS预处理肝脏I/R损伤,激活了Akt通路,使保护性蛋白p-Akt,Bcl-2表达量上升,减少了线粒体内Cyt C向细胞胞浆释放,减少细胞凋亡。推测其保护作用与激活PI3K-Akt通路,抑制内源性和外源性凋亡途径相关。总结：1、与I/R组相比,NaHS组肝脏细胞凋亡数量减少,组织中GSH含量升高,提示H2S预处理对肝脏I/R损伤具有保护作用；2、与I/R组相比,NaHS组线粒体钙容纳力升高,提示H2S预处理可以保护肝脏I/R损伤后的线粒体功能。3、与I/R组相比,NaHS组p-Akt、Bcl-2蛋白表达上升,而Caspase3和胞质中CytC蛋白表达下降,提示H2S的保护作用与激活Akt通路相关。