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萜类化合物是姜花花朵挥发性香气的主要成分,萜类合成酶是催化形成萜类物质的重要关键酶之一。本实验是在已知与白姜花香气密切相关的萜类合成酶基因HcTPSl DNA全长的基础上,采用hiTAIL-PCR技术进行三次扩增,获得了HcTPS15端非编码的候选启动子区,并对其进行了启动活性的验证,为将来利用该启动子进行植物分子育种奠定了基础。具体结论如下:
1、利用hiTAIL-PCR技术克隆出白姜花萜类合成酶基因HcTPS15端的上游序列,总长为1338bp。利用在线软件进行分析预测,发现在172-222 bp,280-330bp,452-502bp和1288-1338bp的位置可能存在基础启动子序列和转录起始位点;HcTPS1的5端上游序列除了具有大多数高等植物启动子所有的TATA-box和CAAT-box等保守序列外,还具有许多与光调控有关的元件,如G-box、GAG-motif,ATCT-motif等反应元件;许多与逆境调控相关的元件,如CGTCA-motif、CAT-box、TCA-element等响应元件。
2、设计了4个5’端缺失的启动子片段取代pCAMBIA1300G质粒的CaMV35S启动子,构建gus报告基因融合植物表达载体pA-gus(含887bp启动子片段)、pB-gus(含1049bp启动子片段)、pC-gus(含l167bp启动子片段)、pD-gus(含1295bp启动子片段)及相应的根癌农杆菌菌株。通过农杆菌介导,用叶盘法侵染烟草将4个缺失融合表达载体转化烟草W38,得到PCR检测为阳性的D类群植株l0株,B类群植株6株。
3、对D类群转基因植株的不同器官进行GUS组织化学染色,发现在花瓣、柱头和花药有不同程度的表达,且受不同发育时期的影响;而在花萼、花梗、叶、根等其它部位均未染上色,说明HcTPS1启动子具有花部组织特异性,为花特异启动子,HcTPS1基因属于花成熟调控基因。对常规条件下不能表达GUS活性的花萼、花梗、叶和根进行物理伤害能诱导花萼、花梗、叶的表达,而根不能表达,证明HcTPS1启动子的表达可被伤害诱惑导。