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华支睾吸虫病(clonorchiasis)又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫(Clonorchissinensis)感染引起的人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫寄生于人或其它终宿主的肝胆管内，可对肝胆系统造成慢性损伤，引起胆管局限性扩张、胆管上皮增生、胆管炎、肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤。全世界将近3500万人感染华支睾吸虫。我国目前感染人数为1249万，分布在除西北数个省区外的25个省，以广东省感染率为最高。
华支睾吸虫作为复殖目吸虫的典型代表，是一种比较好的模式生物。随着模式生物基因组研究的展开，研究者开始通过对华支睾吸虫结构基因组和功能基因组的研究来探讨华支睾吸虫在复杂的生活史过程中其基因的表达调控、能量代谢以及与宿主之间相互作用的分子机制。华支睾吸虫寄生在胆管中，以厌氧代谢为主。其能量代谢的特点，尤其是线粒体在厌氧条件下ATP合酶的结构和功能特征，值得深入研究。本研究主要通过对该基因的研究来了解华支睾吸虫ATP合酶的某些结构和功能特征。
生物信息学的预测结果显示华支睾吸虫ATP合酶b亚基具有线粒体靶向序列和细胞核定位序列，这种截然不同的细胞内区室分布是否真实?调控该蛋白进入线粒体和细胞核的因素是什么?对细胞的能量代谢有什么意义?为了澄清这些疑问，阐明ATP合酶b亚基的亚细胞定位至关重要。蛋白的亚细胞定位，除了通常采用的免疫组化电镜外，利用绿色荧光蛋白作为示踪物，与目的基因在真核细胞中融合表达，也可模拟虫体内蛋白的亚细胞定位。本研究通过设计3种去除靶向序列的突变体基因与绿色荧光蛋白真核载体pEGFP-N1在HeLa细胞融合表达，并对不同细胞周期融合蛋白的定位和表达水平进行观察和测定，探讨华支睾吸虫ATP合酶b亚基的亚细胞定位和参与细胞能量代谢调控的方式。
本研究对于深入了解寄生虫细胞生物学和筛选可能的抗寄生虫药物的新靶点有重要意义。
研究结果
1．CsATP-synt B基因的筛选和鉴定Blastx分析该基因为全长基因，属于ATP合酶b亚基家族，其分子进化树与种系进化过程非常吻合。该基因全长1008bp，其ORF含900bp，编码300个氨基酸，其推导的氨基酸序列与人ATP-synt_B一致性达到41﹪，相似性达59﹪。Predictprotein预测该蛋白是一个膜蛋白，有两个跨膜区(117-134、142-159)；α螺旋(H)、β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分别是68.67﹪：5.67﹪：25.67﹪，二级结构以α螺旋(H)为主。只有少数氨基酸残基包埋在蛋白质内部，大部分氨基酸残基暴露在溶液界面。Mitoprot分析其含有线粒体转运序列(1-29)，Motifscan分析其有核定位序列(染色体二深裂结合区，239-256)和多个磷酸化位点，具有较稳定的理化性质。其编码氨基酸理论分子量为34319.4，理论等电点9.04；去除线粒体转运序列之后，编码271个氨基酸，理论分子量为31131.7，理论等电点7.90。
2．CsATP-synt_B<30-300>基因的原核克隆表达和重组蛋白的免疫组织定位设计引物从质粒cDNA文库中扩增CsATP-synt_B<30-300>，用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA条带在750bp与1000bp之间，测序确定为813bp，与筛选得到的CsATP-synt_B基因cDNA序列一致。定向克隆获得的重组原核表达质粒pET-28a(+)-CsATP-synt_B<30-300>经PCR、双酶切和测序鉴定后证实构建成功。重组质粒在1mmol/L IPTG、28℃下诱导表达重组融合蛋白，经SDS-PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量35781.0相符。将纯化的CsATP-synt_B<30-300>免疫SD大鼠，获得了大鼠抗CsATP-synt_B<30-300>抗血清。重组蛋白免疫大鼠能产生高水平的抗体(ELISA效价达25,600)，表明其具有良好的免疫原性；通过Western-blotting方法，重组蛋白可被免疫血清所识别，表明含有线性表位，与生物信息学手段所做的表位分析和结构分析相符。
经过免疫组织定位，发现CsATP-synt_B<30-300>蛋白在华支睾吸虫成虫虫体的分布比较广泛，几乎遍布整个虫体，其中腹吸盘、卵巢、卵黄腺和体表的荧光比较强，说明在这四个部位能量代谢比较旺盛。
3．CsATP-synt_B在Hela细胞中模拟虫体亚细胞定位与细胞周期的关系设计引物从华支睾吸虫cDNA文库扩增相应的片段，克隆4个真核重组质粒，经PCR、双酶切和测序证实构建成功。
将构建好的真核重组质粒转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，脂质体转染Hela细胞，倒置荧光显微镜下观察各重组质粒的表达，对照组pEGFP-N1在Hela细胞整个细胞都有表达，是均质分布；对照组pEYFP-Mito是定向于线粒体的质粒，它在细胞核中未见有黄色荧光；H<,2>B-CFP是定向于细胞核的质粒，在细胞核中显示青色荧光，在细胞质中未见表达。pEGFP-N1-CsATP-synt_B<1-300>细在Hela细胞的线粒体和细胞核均有表达，同时在线粒体中表达的情况与pEYFP-Mito相符。与3个突变体的比较如下：pEGFP-N1-CsATP-synt_B<30-300>在胞浆中的表达与空载体pEGFP-N1相符都是均质分布于整个Hela细胞，而有些细胞在细胞核中有表达，有些没有，这可能与细胞周期不同时点有关；pEGFP-N1-CsATP-synt_B<(1-238)+(257-300)在Hela细胞中的表达情况与载体pEYFP-Mito相似，在细胞核中少见有表达；而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<(30-238)+(257-300)的表达情况与与空载体pEGFP-N1极其相似，整个细胞在镜下发出绿色荧光。
对转染pEGFP-N1-CsATP-synt_B<1-300>的Hela细胞进行同步化处理，分析在不同的细胞周期该融合蛋白的表达和细胞定位的变化。经过流式细胞术检测，空载体pEGFP-N1在G<,0>/G<,1>期表达量明显下降，而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<1-300>在这个时期表达量是呈上升的趋势。其他细胞周期时相，荧光表达量的变化趋势相似。倒置荧光显微镜观察发现融合蛋白在G<,1>期进入细胞核，其它时期主要分布在线粒体。
在不同的细胞周期，通过对CsATP-synt_B<1-300>和Hela细胞HomoATP-synt_BmRNA的表达进行半定量RT-PCR分析，发现融合蛋白在G<,1>期进入细胞核后，两种基因的表达均成上升趋势，说明融合蛋白进入细胞核是受细胞周期的调控，并且对目的基因CsATP-synt_B<1-300>的表达起活化作用。
研究结论
1．通过华支睾吸虫cDNA文库的筛选结合生物信息学分析手段获得CsATP-synt_B基因，并对其结构和功能进行了预测，发现该蛋白不仅有常见的MTS，还有一段NLS BP，这是个比较罕见的现象。
2．成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-CsATP-synt_B<30-300>，并表达纯化CsATP-synt B<30-000>蛋白。该蛋白具有良好的免疫原性，CsATP-synt B在华支睾吸虫成虫虫体的分布比较广泛，几乎遍布整个虫体，其中腹吸盘、卵巢、卵黄腺和体表的荧光比较强，这四个部位也是华支睾吸虫能量代谢比较旺盛的器官与组织。CsATP-synt_B在虫体的分布与线粒体的分布较一致。
3．成功构建了4个真核重组质粒。pEGFP-N1-CsATP-synt_B<1-300>在Hela细胞的线粒体和细胞核均有表达。这个结果证实了这两段序列是介导蛋白质进入线粒体和细胞核的靶向序列，说明了理论预测的正确性。细胞经过同步化发现，融合蛋白是在Gl期进入细胞核的，其他细胞周期时点主要在线粒体表达。本课题首次发现并用实验证实CsATP-synt B可以在G<,1>期进入细胞核。
4．细胞同步化后流式细胞检测，空载体pEGFP-N1在Gd<,0>/G<,1>期表达量明显下降，而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<1-300>在这个时期表达量是呈上升的趋势。其他细胞周期时相，荧光表达量的变化趋势相似。说明CsATP-synt_B可以装配到宿主人的ATP合酶F0复合体中发挥它的生物学作用，说明两者在进化中的保守性。
5．在不同的细胞周期，半定量RT-PCR分析发现融合蛋白进入细胞核后，目的基因CsATP-synt_B<1-300>及HomoATP-synt B mRNA的表达均成上升趋势，CsATP-synt_B<1-300>上升幅度较大，但两者的表达变化趋势一致，说明融合蛋白进入细胞核是受细胞能量的需求和细胞周期的调控，并且对自身基因CsATP-synt_B<1-300>的表达起正反馈的作用。融合蛋白促进自身基因表达的水平高于宿主细胞同源基因的表达，说明虫源性蛋白和宿主同源基因的调控能力存在差异。
6．在细胞中可能存在某种调节机制，在特定的细胞周期，使CsATP-synt_B的结构发生改变(如磷酸化或去磷酸化，暴露出核定位序列)，进入细胞核，并与核内DNA作用，增强自身基因的表达，为DNA合成和细胞增殖分裂提供充足的物质和能量准备。这部分的内容还有待进一步研究。