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[研究背景与目的]广泛纤维化引起的肝硬化是全球的主要死亡原因,当前尚无有效的治疗措施。血吸虫感染是最常见的肝纤维化病因,全世界约2.4亿人受累,对人类危害较大是日本血吸虫和曼氏血吸虫。我国曾是日本血吸虫病最流行的国家之一,截至2017年底,仍有晚期血吸虫病人近3万例。血吸虫病的主要危害是虫卵引起的免疫病理损害,包括肝脏肉芽肿及随后的纤维化。血吸虫感染后,成虫寄生在肠系膜血管,排出的虫卵随血流大部分滞留在肝组织中,成熟的虫卵分泌可溶性抗原(Solubleegg antigen,SEA),引起偏向Th2的免疫反应,产生的细胞因子和趋化因子,将巨噬细胞(特别是浸润的、单核细胞来源的巨噬细胞)、T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞招募至虫卵周围,并激活肝星状细胞产生大量的细胞外基质,包绕虫卵形成虫卵性肉芽肿。随着病程的进展,这些参与免疫反应的关键细胞,通过减少炎症、启动再生机制进行组织修复,但是雌虫持续产卵导致的反复炎症及修复,则引起进行性纤维化,最终发展为肝硬化、肝腹水、消化道出血等严重并发症,成为晚期血吸虫病人的主要死因。哺乳动物不育系 20 样激酶 1(Mammalian sterile line 20-like kinase 1,MST1)是Hippo途径的关键组分,在巨噬细胞、T细胞等免疫细胞中普遍高表达。在经典Hippo通路中,MST1与激酶LATS1/2以级联磷酸化依赖的方式负调控YAP/TAZ转录共激活因子,从而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡;最近研究发现,以MST1激酶为核心的、非经典的Hippo通路对单核/巨噬细胞的功能发挥重要的调控作用,可以抑制单核/巨噬细胞的炎性表型,从而在减轻炎症调控巨噬细胞对病原菌进行免疫应答。巨噬细胞作为虫卵肉芽肿的主要成分及抗原呈递细胞,具有重要的免疫调节功能,但是,巨噬细胞的MST1在血吸虫肝纤维化中的作用及机制未见报道,课题组前期研究发现:MST1在正常C57BL/6小鼠的巨噬细胞中高表达,而在日本血吸虫感染的肝脏肉芽肿巨噬细胞中低表达,结合文献报道,我们推测内源性MST1可能通过经典和/或非经典的Hippo通路对巨噬细胞的表型和功能发挥调节作用,从而对虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化产生影响。基于以上我们构建了髓系(包括巨噬细胞和粒细胞)特异性敲除MST1小鼠并进行了以下研究。[研究内容及方法]1.日本血吸虫感染小鼠肝组织中MST1动态表达:经皮感染20±2条日本血吸虫尾蚴,建立日本血吸虫感染小鼠模型,定期剖杀小鼠,定量PCR和免疫组化检查肝组织中MST1的表达。2.建立髓系(包括巨噬细胞和粒细胞)敲除MST1的小鼠模型:Mst1flox/flox小鼠与Mst1-/-LysM-Cre(即Mst1△M/△M)小鼠配繁,通过基因型鉴定筛选出Mst1△M/△M小鼠和Mst1flox/flox小鼠,并分离小鼠骨髓、腹腔巨噬细胞,经定量PCR和免疫荧光验证MST1在巨噬细胞中的敲除效果。3.巨噬细胞MST1敲除对血吸虫肝纤维化的影响:建立血吸虫感染的Mst1△M/△M小鼠和Mst1flox/flox小鼠模型,通过HE染色、天狼星红染色,比较肝脏肉芽肿炎症、纤维化程度;通过检测转氨酶活性比较肝功能;进而分析巨噬细胞敲除MST1对小鼠肝脏病理和肝脏损伤的影响。4.巨噬细胞MST1敲除加重血吸虫肝纤维化的机制探讨:收集非感染、感染的Mst1△M/△M、Mst1flox/flox小鼠的腹腔巨噬细胞进行转录组测序,寻找差异表达基因,进行差异基因的信号通路富集分析,并进行PCR验证;Western blot检测肝组织中相关信号分子的磷酸化水平;免疫荧光检测巨噬细胞中YAP的激活入核情况。[结果]1.定量PCR和免疫组化检测均表明日本血吸虫感染小鼠肝脏组织中MST1表达下调。2.定量PCR表明Mst1△M/△M小鼠骨髓巨噬细胞MST1敲除达到60%;而在腹腔巨噬细胞未检测到MST1扩增。3.巨噬细胞敲除MST1的小鼠肝脏肉芽肿面积及纤维化面积大于野生型,血清转氨酶水平升高。4.巨噬细胞转录组测序及分析表明:MST1敲除的巨噬细胞,明显上调促炎、促纤维化因子:TNF-α,TGF-β,IL-13;下调的抗炎细胞因子IL-10、促进基质溶解的MMPs;另外,巨噬细胞清道夫受体CD36明显下调,而促进Th2反应的CD209明显上调。差异基因的KEGG分析显示:PPARγ signal pathway,ECM-receptor interacrion,Hippo signal Pathway,PI3k-Akt signal Pathway;Hedgehog signaling pathway显著富集;定量PCR验证了差异基因的表达。Western blot检测表明感染的Mst1△M/△M小鼠肝脏组织中p-ERK1/2的表达上调;免疫荧光检测表明感染的Mst1△M/△M巨噬细胞中YAP的显著激活,入核增加。[结论]1.血吸虫感染导致C57BL/6小鼠肝脏中MST1表达下调。2.成功构建了巨噬细胞特异性敲除MST1的小鼠模型。3.巨噬细胞敲除MST1导致日本血吸虫感染的小鼠肝脏纤维化加重;与促炎、促纤维化相关基因的表达上调及Th2、Th17反应增强有关;内源性MST1可能通过抑制ERK1/2(非经典Hippo通路)和YAP激活(经典Hippo通路)调控巨噬细胞的表型及功能。