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目的:研究FOXO4-DRI对大鼠体外退变衰老软骨细胞的影响,探讨FOXO4-DRI对大鼠体外退变衰老软骨细胞靶向促凋亡机制。方法:(1)取5周龄的SD大鼠关节软骨,通过胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化离心放入培养箱中培养,获得SD大鼠软骨细胞。(2)使用阿利新蓝、甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色鉴定获取的细胞(3)将实验分为2大组。对照组(ctrl组):第2代取自5周龄大鼠的软骨细胞。退变衰老组(Sen组):第1代取自5周龄大鼠的软骨细胞,经1L-1β处理诱导退变衰老。按照滴加试剂不同,再分为滴加了FOXO4-DRI溶液的ctrl+DRI组、Sen+DRI组和滴加了等体积磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)的ctrl+PBS组、Sen+PBS组。(4)对ctrl组、Sen组滴加不同浓度的FOXO4-DRI,CCK8法测得450nm的吸光度,计算出不同浓度下的细胞存活率,得到FOXO4-DRI最佳作用浓度。(5)在最佳FOXO4-DRI浓度及等体积PBS的作用下对ctrl+DRI组、ctrl+PBS组、Sen+DRI组Sen+PBS组4组培养6天,每天都使用细胞计数板对每组的细胞密度进行监测,绘制生长曲线。(6)在最佳FOXO4-DRI浓度及等体积PBS的作用下,对ctrl+DRI组、ctrl+PBS组、Sen+DRI组Sen+PBS组4组培养6天后进行显微镜下细胞形态观察并做β半乳糖苷酶衰老检测。(7)在最佳FOXO4-DRI浓度及等体积PBS的作用下3天,real-time PCR、western blot检测ctrl+DRI组、ctrl+PBS组、Sen+DRI组、Sen+PBS组软骨细胞Col2α1、P53、caspase3、p16 mRNA及蛋白的表达水平。结果:(1)取自5周龄大鼠的软骨细胞48小时即有大量贴壁细胞,细胞呈短梭形、多角形,折光性强,形态饱满,传代后细胞生长迅速,约3天时间长满。使用1L-1β诱导退变衰老的软骨细胞细胞体积及细胞核较大,折光性变差,细胞表面有指状突起,以簇状细胞群进行生长,传代后约10天长满,生长明显变缓。(2)软骨细胞鉴定,甲苯胺蓝染色胞浆呈蓝色,细胞核呈深蓝色,阿利辛蓝染色显示胞浆为浅蓝色。II型胶原蛋白免疫细胞学检测显示胞浆呈棕黄色。所取得细胞鉴定为阳性反应。(3)FOXO4-DRI浓度在30umol/L之前随着浓度的增加Sen组细胞存活率下降。FOXO4-DRI浓度在在30umol/L时,Sen组细胞几乎全部凋亡,而ctrl组在30umol/L之前细胞存活率无变化,之后才出现了下降趋势。(4)ctrl+DRI组、ctrl+PBS组软骨细胞增殖速度相近且增殖速度均较快,Sen+PBS组软骨细胞也处于增殖状态,但是相对于ctrl+PBS组已是十分缓慢,Sen+DRI组一开始就是处于负增长状态,到第6天时细胞数量已经很少。(5)ctrl+PBS组、ctrl+DRI组可见大量的软骨细胞,但均无染色反应。Sen+PBS组软骨细胞较稀疏些,但是基本上都有深蓝色的染色反应,而Sen+DRI组细胞十分稀疏且大多数无明显软骨细胞形态,呈现细胞体积缩小变圆的凋亡形态,只有少数未凋亡的细胞呈深蓝色染色反应。(6)Real Time PCR检测表明Col2α1在ctrl+DRI组、ctrl+PBS组mRNA的表达明显高于Sen+DRI组、Sen+PBS组。P53、Caspase3、p16 m RNA在Sen+DRI组的mRNA表达明显高于ctrl+DRI组。(7)western blot结果显示ctrl+PBS组和ctrl+DRI组Col2α1的蛋白表达相对于Sen+PBS组、Sen+DRI组明显要高。而凋亡相关基因P53、Caspase3、p16在Sen+DRI组显著升高。结论:FOXO4-DRI在一定浓度下对大鼠退变衰老的软骨细胞具有靶向促凋亡作用,不会影响正常的软骨细胞。这种靶向促凋亡作用与其促进P53表达上调以及Caspase3、p16基因表达上调相关。