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随着近年来人类基因组序列图的完成和分子生物学在止血与血栓研究中取得的巨大进展，几乎所有的凝血因子及血小板膜糖蛋白以及其他相关的成分基因都已被克隆，其结构以及功能的关系也基本阐明。目前很多遗传性出血性疾病的基因异常已被发现，基因诊断也成为今后遗传性出血性疾病研究的发展的主要方向。遗传性无纤维蛋白原血症（Congenital afibrinogenemia）是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，50%发生在近亲婚配家系，发病率约为百万分之一。脐带出血常为首发症状，其后出血症状可以是皮下出血、鼻出血、血尿、女性可以表现为月经血过多，颅内出血为其主要死亡原因。巨大血小板综合征（Bernard-Soulier syndrome，BSS)是一种罕见的先天性遗传性血小板疾病，为常染色体隐性遗传。主要是由于血小板膜GPIb和GPIX先天性质或量的缺陷所致。以出血时间延长、血小板数量减少、血小板体积巨大为特征。本研究分为两部分：第一部分纤维蛋白原Bβ链插入突变导致遗传性无纤维蛋白原血症的发病机制对1例有近亲婚配家族史的遗传性无纤维蛋白原血症家系进行了表型诊断、基因分析、功能检测和体外细胞实验，以探究其分子发病机制。应用Clauss法和免疫比浊法测定血浆纤维蛋白原（Fg）含量，提取先证者及其家系成员外周血DNA，进行PCR法扩增纤维蛋白原FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列，构建纤维蛋白原野生型和突变型质粒进行细胞转染。在患者血浆中加入凝血酶进行纤维蛋白聚集曲线测定；应用Western blot检测血浆纤维蛋白原，用含有FGA，FGB，FGG全长编码序列的基因或FGB突变型质粒转染COS-7细胞后，用Western blot法和ELISA法检测转染后的细胞裂解液及细胞培养上清。研究结果显示先证者的APTT﹥200s，PT﹥100s，TT﹥100s；用Clauss法和免疫比浊法在先证者血浆中检测不到Fg，先证者父亲、母亲、胞弟和儿子的血浆纤维蛋白原活性比正常对照略低;基因分析发现先证者在FGB exon2核苷酸2833～2834之间插入GTTT，该突变为纯合改变，导致纤维蛋白原分子Bβ链在40位氨基酸处发生移码并在50位氨基酸处提前终止。该突变在先证者父亲、母亲、胞弟和儿子为杂合突变；血浆纤维蛋白聚集曲线显示了先证者凝血酶诱导的纤维蛋白聚集曲线无光吸收度，与正常对照相比，患者血浆中无纤维蛋白聚集。免疫蛋白印迹检测血浆中Fg，在非还原条件下缺乏完整的纤维蛋白原分子和纤维蛋白原半分子。而在还原条件下，先证者血浆中无法检测到截短的Bβ链。Western blot分析转染突变型的COS-7细胞裂解液，检测到﹥340KDa异常纤维蛋白原分子，这表明该突变导致纤维蛋白原分子在细胞内组装异常，突变型细胞上清中未检测到纤维蛋白原分子。野生型和突变型质粒转染COS-7细胞后，ELISA法检测细胞裂解液中纤维蛋白原浓度，两者无明显差异；检测细胞培养上清中纤维蛋白原浓度，突变型明显低于野生型。细胞表达实验说明该突变体虽然能在细胞内合成纤维蛋白原分子，但突变的纤维蛋白原分子组装异常和分泌障碍。该基因突变是本家系先证者遗传性无纤维蛋白原血症的发病原因，此突变为国际首例报道。第二部分巨大血小板综合征糖蛋白Ibα基因异常的分子生物学研究应用分子生物学方法证实Ibα基因c.1444del A导致巨大血小板综合征（BSS）并深入探讨该突变在BSS发病中的意义。采集患者及其父母血标本进行血常规、出血时间；ADP、胶原、瑞斯托霉素和肾上腺素诱导血小板聚集实验；血凝仪检测APTT、PT、TT及骨髓象检查；进行PCR扩增GPIbα、GPIbβ与GPIX三种基因全长编码序列，PCR产物直接进行DNA测序分析；流式细胞术检测患者血小板的GPIb与GPIX阳性百分率和荧光强度；构建含有GPIbα突变型质粒,用含有野生型GPIbα，GPIbβ与GPIX或GPIbα突变型全长编码序列的质粒对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞共转染；应用免疫印迹分析转染后CHO细胞胞浆中GPIb-GPIX复合物的表达。患者自幼有大量出血史，经常输注血小板止血。先证者父母为姨表兄妹近亲婚配，其姐姐4岁时死于严重出血。实验结果显示血常规中血小板减少，血细胞涂片见巨大血小板；出血时间﹥20min；ADP、胶原和肾上腺素可诱导血小板聚集，但瑞斯托霉素不能诱导血小板聚集；凝血检查正常和骨髓象正常。GPIb、GPIX和GPV基因分析发现先证者GPIbα基因c.1444del A移码突变，并导致GPIbα基因在510位提前终止(p.Thr452ProfsX58),该突变为纯合改变。先证者父亲和母亲为该基因的杂合突变。流式细胞分析患者血小板膜GPIbα的表达显示GPIbα的百分率及荧光强度均明显减低。体外细胞表达实验显示，转染突变型的CHO细胞胞浆中无GPIb-GPIX复合物表达。说明本例BSS患者的发病机制是由GPIbα基因c.1444del A移码突变所致。