目的：　　 本文主要研究了临床上最为常见的重要致病菌大肠杆菌的耐药质粒所携带的耐药基因种类丰度及其多态性分布。细菌耐药性的改变,往往与细菌所携带的耐药基因通过各种途径传播有关。耐药基因常位于耐药菌所携带的质粒上,可通过质粒或质粒所携带的可移动元件在细菌群体中播散。因此,我们通过对来自不同年份大肠杆菌质粒DNA序列进行高通量测序,从基因水平研究和分析大肠杆菌质粒DNA所携带的耐药基因的种类,数量以及多态性分布,为进一步分析大肠杆菌质粒所携带的耐药基因演变规律和分子进化研究打下基础。　　 方法：　　 本课题以温州医学院附属第一医院临床得到320株大肠杆菌作为本实验菌株来源,其中样本一2002-2003年160株,样本二2008-2009年160株。采用碱裂解法提取质粒DNA,并经电泳实验证实,再将全部质粒DNA送交深圳华大基因研究院进行solexa测序,将两个样本测序得到的短序列通过一系列的生物信息学工具分别与从NCBI的GenBank数据库中收集到的耐药基因序列分别进行比对分析,找出两个样本里所包含的耐药基因类型及丰度的差异,同时找出这些耐药基因存在的核苷酸多态位点,分析是否存在新的亚型。　　 结果：　　 1.第1个样本(E1)中的测序结果产生solexa reads总数为11,077,768,其中可以定位到所收集到的耐药基因参照序列上的约占1.76％。第2个样本(E2)中的测序结果产生solexa reads总数为9,377,792,可以定位到收集到的参照序列上的序列约占1.44％。　　 2.在两个样本的大肠杆菌质粒中含有大量的耐药基因,包括β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、氯霉素类、利福平类和甲氧苄氨嘧啶等9个抗生素抗性家族共计36种耐药基因型,其中有4种基因型只在E1样本中出现。　　 3.两个样本所涉及的所有耐药基因共发现128个位点存在多态现象,其中第一个样本中63个,第二个样本中65个。同一个位点的A/G二核苷酸多态是最常见的多态现象。平行对比两个样本的所有耐药基因,共发现7个SNP位点,他们分布于5个基因型中,其中有4个是非同义突变,即核苷酸的多态性引起了氨基酸的变化。　　 4.在大肠杆菌质粒样本E1中,发现一个染色体编码的β-内酰胺酶blaKluc成员,分析发现该酶与Kluc-2在氨基酸水平上有98％的相似性,并且其覆盖度达到50乘。　　 5.在E1和E2两个样本中,我们均发现了一个oqxAB基因,该基因于2009年首次被发现存在于人源的大肠杆菌质粒上,在本次收集到的人源大肠杆菌质粒中,同样发现其存在。　　 6.tem,strB,strA,flop,aacC2五个基因型始终是两个临床细菌样本中最为流行的抗生素耐药基因型。　　 结论：　　 首先,在方法学上表明新一代高通量测序技术非常适合用来分析多重耐药细菌的质粒基因组的耐药基因分布及遗传变异规律,即便在没有精确参照序列的情况下,同样可以检测和发现样本中存在的基因型。同时也表明,一个Lane的测序数据量足以检测160株细菌质粒基因组上存在的核苷酸多态位点。其次,新一代高通量测序技术对于混合样本中新基因型的筛选同样是一种极为有效的方法。从流行病学角度上看,tem型超广谱β-内酰胺酶仍是温州地区临床多重耐药大肠杆菌质粒携带的最主要耐药基因型。