在过去的几十年,非小细胞肺癌(NSCLC)有着越来越高的发病率,而且预后不良。虽然现在的一线药物阿法替尼提高了患者的存活率,但我们依旧观察到很多病人由于干细胞而对阿法替尼出现了耐药。因此,克服肿瘤干细胞对阿法替尼的耐药性是治疗非小细胞肺癌的关键。β-榄香烯(bELE)是一种从中草药中提取出的化合物,已被发现能够抑制神经胶质瘤干细胞(GSLCs)生长。CD133~+肺癌细胞能够显著抑制肺癌的免疫治疗效果。CD133,也被称为prominin-1,已被广泛用作非小细胞肺癌中的肿瘤干性标志物。OCT-4属于POU结构域转录因子,可在多能干细胞上表达。研究显示,OCT-4参与CD133~+肺癌细胞保持干细胞的特性,而在该细胞的自我更新上,也扮演了很关键的角色。有研究认为,β-榄香烯能够抑制Notch1的激活,抑制胃癌肿瘤干细胞的增殖,促进肿瘤干细胞向正常肿瘤细胞分化,提高肿瘤干细胞对替莫唑胺的敏感性。但在肺癌中(非小细胞肺癌),β-榄香烯是否抑制肿瘤干细胞的增殖目前还鲜有报道。本研究体外培养A549非小细胞肺癌细胞;利用β-榄香烯和阿法替尼干预后,采用分子生物学和细胞生物学等多种手段,研究细胞的增殖能力、肿瘤球的形成、自我更新的能力、OCT4的表达及药物敏感性的变化。从而研究β-榄香烯是否能够增强阿法替尼对非小细胞肺癌的治疗效果,本研究以期在临床上更好的治疗肺癌提供新的靶标和方向。本研究发现,β-榄香烯可抑制肿瘤干细胞的生长,主要是通过抑制OCT4的表达,并由此提高阿法替尼对NSCLC的治疗的效果。目的:1.研究β-榄香烯联合阿法替尼,是否对其对A549细胞的增殖的抑制能力有着增强的作用,及其联合应用是否比其单独应用对A549细胞的凋亡有着更强的促进作用。2.研究β-榄香烯联合阿法替尼对A549细胞的自我更新能力的影响。3.研究β-榄香烯联合阿法替尼是否通过下调OCT-4的表达来抑制具有干性的A549细胞的增殖。方法:1.CCK-8分别检测不同浓度的榄香烯、阿法替尼及榄香烯联合阿法替尼作用后,肺癌A549细胞的细胞活性及其增殖的能力。2.不同浓度的榄香烯、阿法替尼及榄香烯联合阿法替尼作用后,在显微镜下观察进行hoechst33258染色后,各组细胞的形态的变化。3.将各组细胞分别用FITC-CD133及PE-OCT4标记,流式细胞术检测各组A549细胞中CSCs占比变化。4.MTT检测药物药敏性。5.进行肿瘤球形成实验,以此检测不同条件处理后的肺癌细胞的自我更新的能力。6.按分组处理细胞,流式染色,然后镜下观察各组细胞,主要观察其处于凋亡的各个阶段的分布情况,对细胞的凋亡进行探测及分析。7.应用Western blot,检测各组细胞中凋亡蛋白、抑制凋亡的蛋白的表达变化。8.应用qRT-PCR及Western blot,来检测不同浓度的榄香烯、阿法替尼及榄香烯联合阿法替尼作用后细胞OCT-4的表达的变化。结果:1.β-榄香烯和阿法替尼分别作用A549细胞24h,通过分析得到IC50值分别为25μg/ml和5μM。β-榄香烯联合阿法替尼处理的非小细胞肺癌A549细胞的增殖能力被明显抑制2.Hoechst33258染色处理过后,β-榄香烯联合阿法替尼组,细胞活性较其他组明显降低。3.β-榄香烯和阿法替尼组OCT-4阳性细胞的比例分别被降低。与单独组相比,它们的联合应用可更为明显地降低OCT-4阳性细胞比例。4.对预先用β-榄香烯处理6h后的A549细胞,阿法替尼有着抑制其生长的作用,且抑制的作用随着阿法替尼的药物浓度的增加而增强。5.β-榄香烯和阿法替尼的联合应用组肿瘤细胞球形成被明显抑制。6.β-榄香烯增强了阿法替尼促进A549细胞细胞凋亡的能力(P<0.05)。7.β-榄香烯联合阿法替尼应用可使凋亡蛋白表达增强,而抗凋亡蛋白表达被抑制。8.与单用β-榄香烯和阿法替尼相比,它们的联合应用显著降低了OCT-4的表达。与单独应用相比,β-榄香烯和阿法替尼的联合应用也使OCT-4在mRNA水平上的表达被降低。结论:1.β-榄香烯协同增强阿法替尼对A549细胞的增殖的抑制作用及对其凋亡的诱导作用。2.β-榄香烯联合阿法替尼使A549细胞的自我更新能力减弱。3.具有干性的A549细胞的增殖可被β-榄香烯联合阿法替尼应用抑制,且其联合应用可使OCT4的表达下降。