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研究目的:β细胞凋亡是2型糖尿病发生及进展的重要病理因素。胰高糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是近年应用于临床的新型降糖药物,研究证实显示GLP-1受体激动剂(GLP-1 receptor agonist,GLP-1Ra)有抑制β细胞凋亡的作用,然而具体机制目前尚未完全明确。因此,本研究的目的是通过临床部分明确GLP-1Ra对肥胖的2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)患者血糖及胰岛功能的影响,并观察对患者糖脂代谢的影响;进一步建立T2DM大鼠模型,通过高糖钳夹评估大鼠胰岛β细胞分泌功能,并检测AMPKα及NOX2-ROS-JNK信号通路及凋亡蛋白在胰岛及胰腺组织的表达,初步探讨GLP-1Ra对大鼠胰岛β细胞的影响及可能机制;应用INS-1细胞系,结合特异性的信号通路抑制剂,进一步探讨GLP-1Ra是否通过AMPKα-NOX2-ROS-JNK信号通路抑制β细胞凋亡。内容与方法:第一部分临床试验观察GLP-1Ra对肥胖的T2DM患者胰岛功能的影响;根据入组及排除标准在我院门诊连续入组35例肥胖的T2DM患者,给予GLP-1Ra治疗12周(第1周0.6mg/d,2-12周1.2mg/d)。1.观察GLP-1Ra对患者一般情况、血糖、生化指标的影响;2.行口服葡萄糖耐量及C肽释放试验,应用稳态模型计算HOMA2-IR及HOMA2-%β指数,评估GLP-1Ra对胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)及胰岛β细胞功能指数的影响。第二部分动物实验观察GLP-1Ra对T2DM大鼠β细胞分泌功能的影响,并观察对氧化应激及相关信号通路关键蛋白的影响应用雄性SD大鼠建立T2DM动物模型,将动物分3组:对照组、糖尿病组、GLP-1Ra治疗组(GLP-1组),每组12只,观察12周。1.观察GLP-1Ra对大鼠的行为、体重、进食量、血糖及生化指标的影响;2.进行高葡萄糖钳夹,酶联免疫吸附法测定各组大鼠胰岛素水平;3.HE及免疫荧光双重染色观察GLP-1Ra对T2DM大鼠胰岛组织形态学及α、β比值的影响;4.TUNEL法、免疫组织化学及Western blot观察GLP-1Ra对胰岛及胰腺组织凋亡的影响;5.DCFH-DA荧光探针检测GLP-1Ra对胰岛活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的影响;6.免疫组化及Western blot观察GLP-1Ra对信号通路关键蛋白AMPKα-NOX2-JNK1/2水平的影响。第三部分细胞实验应用INS-1细胞系给予GLP-1Ra及特异性NOX2及JNK抑制剂,干预48h,探讨GLP-1Ra是否通过AMPKα-NOX2-ROS-JNK信号通路抑制β细胞凋亡;1.应用Annexin V-FITC/PI流式细胞术及Western blot检测GLP-1Ra对细胞凋亡的影响;2.DCFH-DA荧光探针检测GLP-1Ra对ROS产生的影响;3.Western blot检测细胞内NOX2、AMKPα、p-AMKPα、JNK1/2、p-JNK1/2、Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平;结果:第一部分1.GLP-1Ra治疗12周后患者的,FBG、P2BG及HbA1c均明显下降;sFCP、HOMA2-%β升高,HOMA2-IR下降。2.GLP-1Ra治疗后患者的体重、BMI、SBP、DBP、TG及TC均下降,HDL-c升高。第二部分1.T2DM动物模型成模率91.7%,N组、T2DM组及GLP-1组死亡率分别为8.3%、27.3%、18.2%,死亡率无统计学差异。2.GLP-1Ra治疗后T2DM大鼠毛色、行为改善,日均进食量低于T2DM组,而体重较T2DM组恢复;3.GLP-1Ra治疗组大鼠的周平均血糖及Hb A1c以及胆固醇水平均低于T2DM组,但仍高于N组;4.GLP-1Ra治疗组大鼠的GIR及胰岛一相、二相胰岛素分泌均明显高于T2DM组,但未恢复至N组水平;5.HE结果显示GLP-1Ra治疗组T2DM大鼠的胰岛组织形态改善,免疫荧光结果显示胰岛素荧光值增加,胰高糖素下降,α、β细胞比值下降;6.TUNEL、免疫组化及Western blot结果均显示GLP-1治疗后胰岛及胰腺组织凋亡率较T2DM组明显下降;7.经GLP-1以及给予特异性NADPH氧化酶NOX2(gp91phox)抑制剂Apocynin(加拿大麻素或夹竹桃麻素)后胰岛ROS水平明显降低;8.免疫组化结果显示T2DM组大鼠胰岛p-AMKPα表达下降,而NOX2及p-JNK1/2表达水平升高,GLP-1Ra治疗后p-AMKPα升高,NOX2及p-JNK1/2均下降。Western blot检测胰腺组织中的结果与免疫组化结果一致;第三部分1.AnnexinⅤ/PI双染流式细胞仪及Western blot检测均显示GLP-1Ra能显著抑制高糖诱导的INS-1细胞凋亡;2.高糖诱导的INS-1细胞中NOX2蛋白水平明显升高,给予GLP-1或特异性抑制剂处理后,能明显抑制NOX2蛋白水平,两者联合应用后NOX2水平未见进一步下降;3.高糖可诱导INS-1细胞内ROS水平明显升高,给予GLP-1Ra或特异性NOX2抑制剂后,ROS生成减少,同时联合应用抑制剂及GLP-1后ROS水平未见进一步下降;4.高糖诱导p-AMKPα表达减少,p-JNK1/2增加,给予GLP-1Ra干预后p-AMKPα表达增加,单用GLP-1或特异性JNK抑制剂后p-JNK1/2表达水平下降,细胞凋亡减少,两者联合后抑制作用未见明显增加。结论:1.临床试验显示GLP-1Ra能显著改善肥胖的T2DM患者的糖代谢,并能改善患者的β细胞功能和胰岛素抵抗。2.动物及细胞实验结果显示,GLP-1Ra治疗能改善T2DM大鼠胰岛一相、二相分泌及组织形态学,降低α/β细胞比值,并能显著降低胰岛及β细胞的凋亡,AMPKα-NOX2-ROS-JNK信号通路可能是GLP-1Ra抑制β细胞凋亡的重要机制之一。