【研究目的】作为一种恶性程度较高的肿瘤疾病,原发性肝癌的死亡率在世界范围内位居第三位。其中,肝细胞癌(HCC)占人类原发性肝癌的85%-90%,并且几乎对所有现有的治疗方法都有一定的抗性。众所周知,正常肝细胞癌变的过程得益于大量有害突变的累积,并且许多与癌变相关的突变发生在基因组的非编码区域。而对于癌细胞整个转录组来说,接近98%的转录本是所谓的非编码RNA(ncRNAs)分子。长期以来,研究结果表明ncRNAs分子可以作为重要的调节因子调控相关肿瘤的的发生发展。已经报道的ncRNAs分子可以通过不同的分子机制影响癌细胞的多种特性,诸如细胞增殖、细胞周期进展、凋亡或细胞侵袭、细胞迁移。其中,长链非编码RNA分子(lncRNAs)因为与多种肿瘤的恶性表型相关,引起了研究人员的广泛关注。研究表明,lncRNAs分子在多种人类肿瘤中表达失调,其调控癌基因或抑癌基因表达的相关分子机制是较为复杂的。然而,尽管已有许多的研究结论,lncRNAs分子或其它ncRNAs分子在生物有机体正常发育过程中和众多疾病诸如癌症发生发展中的重要作用仍然是一个较为活跃的研究领域。越来越多的证据表明,部分带有小的开放式阅读框(smORFs)序列的ncRNAs分子具有特殊的结构,包括位于5’端甲基鸟苷帽子结构、3’端的polyA尾和部分发夹结构。例如,含有smORFs序列的lncRNAs分子转录后被运输到细胞质并可以进一步被核糖体捕获而参与翻译活动得到相应的多肽或蛋白产物,这些产物有可能具有重要的功能。这些潜在的多肽或蛋白分子可能参与了肿瘤的发生发展,并且具有作为肿瘤治疗靶标的潜能。因此,我们推断对于肝癌来说可能存在由ncRNAs分子编码而产生的功能性小的多肽或蛋白分子发挥了重要的与肿瘤发展相关的作用。然而,其中所涉及到的具体分子机制还需要进一步探究。因此,鉴于lncRNAs分子在不同癌症类型中表达的组织特异性和广泛性,我们假设存在一些由lncRNAs分子翻译的、未被鉴定的功能性多肽分子可能调节了肝癌的进展,并满足肝癌细胞保持自身特性的需要。上述研究也有助于确定以新的ncRNAs/多肽分子为基础的肝癌诊断和治疗策略。【研究方法】本课题所采用的研究方法如下所述:1.利用Rip-seq技术筛选癌细胞中与核糖体结合的lncRNAs分子并分析验证其表达差异。借助于RNA免疫共沉淀高通量测序并结合核糖体蛋白RPS6抗体,对癌细胞系中与核糖体结合的mRNAs分子和lncRNAs分子进行分析,并结合GO分析和KEGG分析对上述分子进行说明。利用ORF finder与CPC软件对相关分子的编码潜能进行分析,并进一步利用qPCR检测了目标分子的表达情况。2.检测目标lncRNA分子LINC00998编码翻译产生的多肽分子并分析其相关特性和在肝癌组织中的表达差异。通过RACE鉴定目标分子的确切序列,采用FISH方法检测目标分子的亚细胞定位。设计相关质粒、制作相应抗体并结合多种在线工具诸如ClustalX、TMHMM、ProtScale和Signal IP 4.0,对LINC00998的编码产物及其结构性能进行深入的验证分析。3.目标lncRNA分子LINC00998及其翻译产生的多肽分子SMIM30的分子功能分析及动物模型验证。通过特异的shRNA序列下调了肝癌细胞中LINC00998/SMIM30分子的表达,并结合CCK8、EdU、Transwell、细胞周期和细胞划痕等一系列细胞功能学实验,体外检测LINC00998/SMIM30的分子功能。利用功能拯救实验,确定发挥功能的主体。建立小鼠皮下荷瘤模型及肝脏移植瘤模型,体内检测SMIM30多肽分子的功能。4.Co-IP结合质谱分析鉴定多肽分子SMIM30结合的蛋白分子及相关结合的结构域。采用Co-IP并结合质谱分析鉴定与多肽分子SMIM30结合的功能蛋白分子及相关结构域。并利用免疫荧光双标方法对多肽分子SMIM30及其结合的蛋白分子进行共定位。5.多肽分子SMIM30促进肝癌发生发展的分子机制探讨。利用生物信息学的方法分析并结合双荧光素酶和染色质免疫共沉淀实验寻找LINC00998分子上游转录调控因子。通过转录组测序及相关分析,确定了与SMIM30多肽分子相关的信号通路变化并利用qPCR和WB方法进行验证。【实验结果】本研究通过结合RPS6抗体的RIP-seq技术鉴定得到了在癌细胞系中与核糖体结合的lncRNAs分子。上述lncRNA分子在基因组上分布较为均匀,且具有编码翻译功能性多肽或蛋白分子的潜能。结合qPCR测定和数据库分析,我们发现lncRNA分子LINC00998在肝癌组织中高表达且与肝癌患者预后和肝癌不同分期相关,该分子在多种肝癌细胞系中也有较高的表达。FISH实验结果表明带有smORFs序列的LINC00998分子定位在细胞质。我们进一步发现上述特异smORFs序列翻译产生了多肽分子SMIM30。多肽分子SMIM30的表达是内源性的,并且在肝癌组织中表达量升高。并且作为一个膜分子,多肽分子SMIM30不仅定位在细胞膜,且具有较为显著的膜定位引导能力。多肽分子SMIM30的序列较为保守,具有显著的信号肽剪切位点、跨膜结构域和较强的疏水性。多肽分子SMIM30具有重要的促进肝癌细胞生长、增殖和侵袭、迁移的作用,并在一定程度上改变了肝癌细胞的周期。因此,SMIM30多肽分子是一个关键的肿瘤促进因子。多肽分子SMIM30可以与非受体型酪氨酸激酶SRC/YES1相结合,并引导上述两个分子锚定于细胞膜的特定区位。多肽分子SMIM30通过介导SRC/YES1的细胞膜定位而促进上述两个激酶由失活状态向活化状态的转变。进一步,敲低多肽分子SMIM30表达之后,肝癌细胞多种信号通路发生了很大的的变化,其中MAPK通路的改变与SRC/YES1相关。通过一系列的蛋白靶标验证,我们发现SMIM30-SRC/YES1蛋白复合物通过调控ERK/p38-MAPK信号通路而促进了肝癌的发生发展和转移。上述研究结果有助于开发全新的基于ncRNAs/多肽的诊断策略和治疗靶标。【结论】癌细胞中存在着大量与核糖体结合并具有翻译潜能的lncRNAs分子。lncRNA分子LINC00998在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达,且与肝癌预后相关。而由LINC00998分子编码产生的多肽分子SMIM30也在肝癌组织中表达量显著升高。而通过对多肽分子SMIM30的结构和特性进行分析,发现其序列较为保守,是一个具有较强膜定位效能的膜分子。另外,其具有显著的跨膜区域、信号肽剪切位点和较强的疏水性。进一步,我们证实是多肽分子SMIM30而不是lncRNA分子LINC00998,促进了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并改变了细胞周期。多肽分子SMIM30通过结合SRC/YES1并引导其定位于细胞膜而促进了其状态的活化。而SMIM30-SRC/YES1复合物通过调控ERK/p38-MAPK信号通路促进了肝癌的发生发展和转移。