第一部分:假性维生素D缺乏性佝偻病患者25-羟维生素D-1α-羟化酶基因突变研究目的:假性维生素D缺乏性佝偻病（pseudo-vitamin D-deficiency rickets,PDDR）,是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病,由CYP27B1基因突变造成其编码的25-（OH）D-1α-羟化酶功能缺失,导致1,25双羟维生素D3（1,25-（OH）₂D₃）生成不足而致病,患者幼年就会出现严重佝偻病的表现。目前已经发现的CYP27B1基因突变有30多种,但国外研究中仅有1例中国PDDR患者CYP27B1基因突变结果的报道,因此本研究的目的是分析中国汉族PDDR患者CYP27B1基因突变位点,并试图了解中国汉族人PDDR的致病基因突变的分布特征,为PDDR的遗传学病因研究提供依据。对象和方法:1.收集临床相关资料:对临床确诊的3例PDDR患者和部分家庭成员详细询问记录患者病史,进行体格检查,完成相关的实验室和X线检查,并对以上资料进行收集整理,绘制家系图。2.外周静脉血白细胞DNA的提取:获得知情同意后抽取患者和部分家庭成员外周静脉血,应用QIAGEN全血DNA提取试剂盒提取白细胞DNA。3.PCR扩增CYP27B1基因片段:应用引物设计软件primer premier 5等设计CYP27B1扩增引物,其中包含9个外显子及其内含子的相邻区,通过预实验确定PCR扩增条件。4.PCR产物测序和分析:扩增后的PCR产物首先经过2%琼脂糖电泳检测无误后送测序公司进行测序,测序结果与GENEBANK进行比对碱基变异。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳:对发现了碱基缺失和插入的标本再应用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,进一步验证测序结果。6.克隆测序:将出现移码突变的PCR扩增片段连接到载体上,导入大肠杆菌中,铺板培养后挑取阳性克隆菌落,进一步培养,提取质粒后进行单克隆测序。结果:1.临床资料:3例患者均具有明显的佝偻病症状、体征和x线表现,如低钙血症、高磷血症,高PTH血症和血碱性磷酸酶（ALP）水平显著升高。除了3例患者外的家系成员的血钙、磷和ALP均属正常。2.测序突变检测结果:对CYP27B1基因PCR产物测序研究表明:在这3个家系中共发现4种遗传变异,其中包括1个错义突变和3个移码突变。患儿1的CYP27B1基因1号外显子存在上57位密码子（c170G＞T）发生了GGG→GTG的变异,由甘氨酸变为缬氨酸（G→V）,8号外显子存在442密码子（c1325-1332insCCCACCC）第二位C后有CCCACCC 7bp插入,造成了移码变异,使其后编码的氨基酸发生了变异,并于466位出现了终止密码子UAG,比正常序列缺失了43个密码子,以上两个突变分别在患儿的父母等家系成员中得到证实。患儿2的CYP27B1基因变异与患儿1相同。患儿3 CYP27B1基因的8号外显子437位氨基酸密码子GGG中缺失了一个G（c1310delG）,之后序列出现移码突变,并于460位出现终止密码子UAA,提前终止,缺失了36个氨基酸（AG）。在第9外显子上481位氨基酸GAG第二位A缺失（c1442delA）造成移码突变,同时使编码的氨基酸不能正常终止于509密码子,增加了30个氨基酸,最终终止于539位（△A）。3.PAGE胶电泳检测结果:出现移码突变的外显子PCR产物经page胶电泳后,分别在患者和其父系或母系其中一方亲属PCR标本中发现了异常片段,支持测序结果。4.克隆测序结果:上述3个移码突变PCR扩增片段经克隆测序后进一步证实了患者1和2 CYP27B18号外显子7bp插入（c1325-1332ins CCCACCC）,患者3 CYP27B18号和9号外显子上分别存在一个碱基缺失,与测序结果相符（c1310delG和c1442delA）。结论:1.本研究在国内首次对PDDR患者CYP27B1基因进行了突变研究分析,在3例患者PDDR患者中存在CYP27B1基因的四种突变类型。2.发现了尚未报道的3种新突变,1种错义突变:1号外显子的c170G＞T（G57V）;2种缺失突变:位于8号外显子的c1310delG（437△G）和9外显子的c1442delA（481△A）。3.8号外显子7bp插入（c1325-1332insCCCACCC）突变与以往国外报道的突变类型相同,说明此种突变在不同种系中比较多见。第二部分SIP1对成骨细胞特异转录因子Cbfal基因表达的影响及其在BMP2信号传导通路中的作用目的成骨细胞是由间充质的前体细胞分化而成的,主要作用是合成骨基质和调节破骨细胞的骨吸收活性,在骨形成和骨重建过程中发挥重要作用。前成骨细胞向成骨细胞的分化成熟受多种因子的调节,除了已知的活性维生素D、甲状旁腺素和降钙素三大经典的钙磷调节激素及性激素、生长激素等循环激素外,目前认为骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的局部调节因子。BMPs信号传导通路可使下游的Smadl、Smad5和Smad8蛋白磷酸化,进入细胞核,调节核内转录因子包括核心结合因子（Core binding factorα1,Cbfal）的活性。Cbfal是成骨细胞特异转录因子,能够调节细胞核内多种基因的转录和翻译,是BMPs通路及其它调节成骨信号通路的关键因子,并且它可能是多条通路的信号整合在一起的集结点,成为调节成骨细胞的分化和骨形成的关键“阀门”。Smad相互作用蛋白1（Smad-interacting Protein 1,SIP1）可以与BMPs通路上重要的调节因子Smad蛋白结合,可能对成骨细胞的分化也起到调节作用。前成骨细胞MC3T3-E1和前成肌细胞C2C12给予BMP2刺激后,可以分化为成骨细胞。因此本研究目的在于采用MC3T3-E1和C2C12细胞观察SIP1对Cbfal基因的调节,及其促进成骨细胞分化以及BMPs信号传导通路中的作用。方法1.SIP1l对前成骨细胞和前成肌细胞Cbfal基因启动子活性的影响采用本室保存的p696-luc质粒,其中含Cbfal启动子-641bp—+55bp序列的荧光素酶报告基因。本室构建的pcDNA3.0—SIP1质粒为将小鼠SIP1编码序列克隆至pcDNA3.0载体EcoRI/XbaI位置上的SIP1基因表达质粒。并应用pGL3-Basic作为对照质粒,PRL SV40为内参照质粒。瞬时转染p696-luc和内参照质粒PRL SV40至MC3T3-E1和C2C12细胞中,24hr后加入不同浓度BMP2,继续培养6hr后收集细胞,测定荧光素酶活性。另外,在瞬时转染p696-luc和内参照质粒PRL SV40同时共转染pcDNA3.0-SIP1质粒及对照pGL3-Basic质粒至MC3T3-E1和C2C12细胞中,24hr后加入BMP2,继续培养6hr后收集细胞,测定荧光素酶活性。2.SIP1对前成骨细胞和前成肌细胞BMP2信号传导通路的影响将pcDNA3.0-SIP1和对照质粒瞬时转染入MC3T3-E1和C2C12细胞中,转染后24hr更换培养液并在部分组中加入BMP2,再培养6hr后收集细胞,提取总RNA,应用RT-PCR技术检测Cbfal、Smadl和SIP1基因表达情况。3.SIP1对ALP表达的影响pcDNA3.0-SIP1质粒瞬时转染MC3T3-E1细胞30hr,细胞生长至80-90%后进行ALP染色,倒置显微镜下观察细胞胞质中碱性磷酸酶染色的变化。结果1.SIP1对前成骨细胞和前成肌细胞Cbfal基因启动子活性的影响在瞬时转染了p696-luc的C2C12和MC3T3-E1细胞中,300ng/ml浓度的BMP2作用6hr后,相对荧光素酶活性分别是对照组的1.45（P＜0.01）和1.45倍（P＜0.01）。C2C12细胞中转染pcDNA3.0-SIP1后,相对荧光素酶活性有明显升高（1.59±0.04,p＜0.01）,这种作用与BMP2的作用可以叠加（3.21±0.22,p＜0.01）。在前成骨细胞MC3T3-E1中,转染pcDNA3.0-SIP1质粒后,相对荧光素酶活性同样增高（1.77±0.13,p＜0.01）,并且这种促进作用与BMP2作用有叠加效应（2.85±0.49,p＜0.05）。本研究结果提示BMP2可以促进Cbfal基因启动子活性。SIP1也促进了Cbfal基因启动子活性,并且可以叠加BMP2的作用。2.SIP1在BMP2信号通路中的作用瞬时转染pcDNA3.0-SIP1质粒和对照质粒pGL3-Basic-Basic后提取RNA,并应用RT-PCR的方法检测Cbfal、Smadl和SIP1 mRNA水平。结果发现在C2C12细胞中,BMP2可以增加Cbfal、Smadl基因和SIP1基因表达（1.40±0.21,p＜0.05;1.49±0.36,p＜0.05;2.36±1.10,p＜0.05）;转染pcDNA3.0-SIP1质粒后,Cbfal和Smadl基因表达均增加（1.25±0.12 p＜0.05;1.49±0.61,p=0.10）,但是对Smadl基因表达无统计学差异。在MC3T3-E1细胞中结果有所不同,BMP2对Cbfal和Smadl基因表达都有促进作用（1.52±0.20,p＜0.05;1.68±0.53,p＜0.05）,但对SIP1基因无明显作用作用,（1.12±0.33,p=0.51）;转染pcDNA3.0-SIP1质粒后,Cbfal基因表达升高（1.56±0.54,p＜0.05）,Smadl基因表达也增加（1.92±1.02,P=0.08）但无统计学差异。上述结果表明BMP2可以促进Cbfal和Smadl基因的表达,对于SIP1基因表达的影响不明确。过表达SIP1蛋白,可增加Cbafl基因表达,但是对于Smadl基因表达影响尚不清楚。3.SIP1对前成骨细胞MC3T3-E1碱性磷酸酶表达的影响本研究应用碱性磷酸酶染色的方法来检测MC3T3-E1细胞胞质内碱性磷酸酶表达水平的变化。加入BMP2刺激后,MC3T3-E1细胞质内碱性磷酸酶阳性颗粒明显增多,提示骨形成增加。瞬时转染pcDNA3.0-SIP1质粒30hr后MC3T3-E1细胞胞质内碱性磷酸酶阳性颗粒明显增多,说明SIP1同BMP2-样也增加前成骨细胞MC3T3-E1中ALP的表达。结论1.SIP1对Cbfal基因启动子活性和的基因表达有正向调节的作用,并可与BMP2呈叠加作用。2.SIP1能够增加前成骨细胞细胞内ALP表达,增加骨形成,能够促进前成骨细胞向成骨细胞分化。3.SIP1尽管可能增加BMP2的作用,但其作用可能发生在Smadl以下的信号传导通路上。