论文部分内容阅读
合理的动物模型对2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus,T2DM)的研究至关重要。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)对胰腺组织β细胞具有特异毒性作用,因此被广泛应用于糖尿病动物模型的制作。高脂高糖食物联合低剂量STZ诱导T2DM模型具有造模时间短,成模率高和造模成本低等特点,是目前应用最广泛的造模方法,但是人类T2DM的发生与STZ没有直接的关系,目前最理想的T2DM模型制作方法仍为高脂高糖自然食物诱导。本研究旨在通过构建高脂高糖食物联合低剂量STZ诱导和单纯高脂高糖食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型,分别进行模型猪肝脏组织转录水平和蛋白水平的差异分析,并完成差异候选基因在细胞表达水平和小鼠T2DM模型中的表达验证,为T2DM动物模型的合理应用提供科学的理论依据。主要试验结果如下:1、STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型构建选取22头20-22 kg雌性巴马小型猪用于T2DM模型制作。随机分为4组:第一组(n=4)用基础饲料饲喂10个月(Control,Ctrl);第二组(n=10)高脂高糖饲料饲喂10个月(DM1_HH);第三组(n=4)先高脂高糖饲料饲喂6个月后按60 mg/kg耳缘静脉注射STZ,接着高脂高糖饲喂至10个月(DM2_HS);第四组(n=4)先基础日粮饲喂6个月后按60 mg/kg给予耳缘静脉注射STZ接着高脂高糖饲喂至10个月(DM3_SH)。DM2_HS组和DM3_SH组小型猪全部达到T2DM标准,DM1_HH组有4头小型猪造模成功(4/10)。其中,先高脂高糖饲喂后注射STZ(DM2_HS)能够诱导出高血糖T2DM模型。组织病理分析发现长期高脂高糖饲喂组(DM1__HH,DM2__HS)肝脏发生严重的小泡性脂肪变;STZ处理组(DM2_HS,DM3_SH)小型猪胰腺组织受损严重。2、STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏转录组分析分别选取4组实验小型猪各3头用于肝脏转录组分析,同时达到|log2(Fold Change)|>1和校正p-value<0.05则被认定为差异表达基因,结果与DM1_HH组相比,DM2_HS组有17个差异表达基因,其中7个为上调基因,10个为下调基因;DM3_SH组有30个差异表达基因,其中16个为上调基因,14个为下调基因。与DM1_HH组相比,一共有4个共表达差异基因同时注释到DM2_HS组和DM3_SH组,分别为CYR61基因,RPL15基因,RGS1基因和一个未知非编码基因LOC102166695,其中CYR61基因,RPL15基因和RGS1基因均为下调表达基因。3、STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型肝脏蛋白质组分析分别选取T2DM模型组小型猪各3头用于肝脏蛋白组学分析,结果显示与高脂高糖自然食物诱导的DM1_HH组相比,一共有50个共表达差异蛋白同时注释到DM2_HS组和DM3_SH组。差异蛋白所涉及的代谢通路涵盖了氨基酸代谢,碳水化合物代谢和化学药物致癌等途径。差异蛋白分析显示,STZ处理组中的UGT2B31和UGT1A62个UGT家族下调蛋白同时参与了氨基酸,碳水化合物和化学药物致癌等通路,初步确定UGT蛋白参与STZ在肝脏中的代谢。STRING数据库在线分析发现RPL家族有3个蛋白(14、15、35A)通过GMPR2 还原酶与 GPT2、ME3、AGXT、HACL1、RDH11、AKR1A1、CBR3 和 UGT2B31(ENSSSCG00000024213)存在互作关系。蛋白质组学和转录组学联合分析发现,STZ诱导的小型猪T2DM模型肝脏组织中RPL15基因在转录水平和蛋白水平均呈现下调表达模式,证明STZ在诱导糖尿病的发生过程中能够下调RPL15基因在肝脏中的表达,Western Blot试验验证了这一结果。4、候选基因RPL15的克隆和细胞水平的功能验证克隆广西巴马小型猪RPL15基因,发现RPL15基因具有高度的保守性,与NCBI公布的猪(Sus scrofa)的RPL15基因同源性高达99.8%,在CDS区第339位点发生G/A同义突变,未引起氨基酸序列的改变。通过在HEPG2肝脏细胞中分别进行干扰和过表达RPL15试验,初步确定RPM15基因与AGXT、RPL14、AKR1A1、GMPR2和UGT2B31存在稳定的互作关系。过表达RPL15可促进癌基因DLK1、HTA、MXR7和抑癌基因P53的表达,同时抑制抑癌基因PTEN的表达;干扰RPL15基因可促进抑癌基因PTEN、NDRG1的表达。5、候选基因RPL15在小鼠T2DM模型中的表达分析通过高脂高糖饲料联合低剂量STZ(60 mg/kg每天单次腹腔注射,连续注射3d)分别构建昆明小鼠T2DM模型。T2DM模型小鼠组织表达分析发现,RPK15基因在小鼠肌肉、肾脏和肝脏组织中表达较高。与单纯高脂高糖饲喂诱导的mHH组相比,高脂高糖饲喂联合低剂量STZ诱导的mHS组和mSH组小鼠心脏、肝脏、肌肉和肾脏中RPL15基因均呈现下调表达趋势。模型小鼠肝脏中RPL15基因在mHH组中的表达高于mHS组和mSH组,与巴马小型猪T2DM模型研究结果相同。综上所述,本研究成功构建STZ和食物诱导的广西巴马小型猪T2DM模型,完成了模型猪肝脏转录组和蛋白质组的差异分析,并获得肝脏转录水平和蛋白水平的差异表达基因,确定STZ在诱导T2DM的发生过程中下调肝脏中RPK15基因的表达。