论文部分内容阅读
目的:检测4株子宫内膜癌细胞株HEC-1A、HEC-1B、ishikawa、RL-952细胞中YKL-40基因的表达水平,筛选相对高表达YKL-40基因的子宫内膜癌细胞株。同时通过RNA干扰(RNAi)技术靶向抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞中的YKL-40基因的表达,构建稳定沉默YKL-40基因的子宫内膜癌细胞株。方法:1、用荧光定量PCR(q PCR)的实验方法检测子宫内膜癌细胞株HEC-1A、HEC-1B、ishikawa、RL-952细胞中YKL-40基因的表达水平。2、通过RNAi技术构建YKL-40 siRNA慢病毒载体。3、细胞转染:用特异性YKL-40 siRNA基因序列制备的慢病毒载体,转染人子宫内膜癌HEC-1A细胞。4、实验分组:将人子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞分为3组。实验组(E.G):转染含有YKL-40 siRNA的慢病毒,即siRNA实验组;空载体组(mock):转染只含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒;空白对照组(blank):未进行转染的人子宫内膜癌细胞。将人子宫内膜癌HEC-1A细胞置于5%CO2、37°C培养箱中常规培养。取生长状态良好的癌细胞进行转染。5、构建稳定转染的子宫内膜癌细胞株:用嘌呤霉素筛选稳定沉默YKL-40基因表达的子宫内膜癌细胞株。耐嘌呤霉素的细胞则用于后续实验。6、用q PCR实验检测转染前后子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞中YKL-40基因的表达水平,即YKL-40基因的沉默水平。7、用Western Blotting实验检测转染前后子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞中YKL-40蛋白的表达水平。结果:1、4株子宫内膜癌细胞株细胞中YKL-40基因的表达水平比较:HEC-1A、HEC-1B、ishikawa、RL-952细胞中YKL-40 m RNA的相对表达水平分别为:1.0052±0.13,0.0024±0.00,0.0017±0.00,0.0032±0.00。4株细胞中均有YKL-40基因表达,HEC-1A细胞中YKL-40基因的表达相对最高,用于后续基因沉默细胞模型的建立。2、成功构建YKL-40 siRNA慢病毒载体,病毒滴度为1×108PFU/ml。3、细胞转染:转染成功的细胞则带有绿色荧光蛋白(GFP),未转染成功的细胞则不带有绿色荧光蛋白。转染效率(带绿色荧光的癌细胞)达80%以上。4、构建稳定转染的子宫内膜癌细胞株:用嘌呤霉素筛选的转染后的细胞,未成功转染未表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞则被嘌呤霉素杀死,表达GFP蛋白的细胞则被成功筛选出来。5、转染后HEC-1A细胞中YKL-40 m RNA表达水平的比较:实时荧光定量RT-PCR(q PCR)技术检测显示,siRNA组、空载组、空白对照组细胞中YKL-40 m RNA相对表达水平分别为0.31±0.27、1.33±0.62、1.01±0.12,siRNA组明显低于空载体组和空白对照组(P<0.05);而空载体组与空白对照组比较,差异则无统计学意义(P>0.05)。6、转染后HEC-1A细胞中的YKL-40蛋白的表达水平比较:经过Western Blotting实验检测转染前后子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞中YKL-40蛋白的表达水平未见明显差异(P=0.061),可能有基因翻译出来的蛋白质有关,或者检测的时候YKL-40蛋白降解。结论:子宫内膜癌HEC-1A细胞有相对表达量高的YKL-40基因水平,可用于沉默细胞中YKL-40基因的表达水平,作为后续实验的基础。构建的慢病毒载体可成功抑制干扰人子宫内膜癌HEC-1A细胞中YKL-40基因的表达水平,为后续细胞模型的建立奠定基础。目的:探讨siRNA沉默YKL-40基因表达对人子宫内膜癌HEC-1A细胞体外生物学性状(增殖、迁移、侵袭以及凋亡)的影响以及对顺铂化疗敏感性的影响。方法:1、实验分组同前。MTT实验检测3组细胞的增殖能力。2、Transwell小室迁移和侵袭实验检测3组细胞的迁移和侵袭能力。3、MTT实验检测基因转染前后人子宫内膜癌HEC-1A细胞对顺铂化疗的敏感性。4、顺铂处理子宫内膜癌HEC-1A细胞对细胞中YKL-40基因的影响。5、流式细胞仪检测技术(Annexin V-PE/7AAD双染法)检测转染前后3组细胞对顺铂化疗的总凋亡率。结果:1、转染后3组HEC-1A细胞增殖能力的比较:MTT比色法检测显示,与空载体组和空白对照组比较,siRNA组细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05);而空载组与空白对照组比较,差异则无统计学意义(P>0.05)。2、转染后3组HEC-1A细胞迁移能力的比较:体外transwell小室迁移实验显示,siRNA组穿膜细胞数为(133±14)个,明显少于空载体组和空白对照组[分别为(178±11)和(179±19)个,P<0.05];而空载体组与空白对照组比较,差异则无统计学意义(P=0.872)。3、转染后3组HEC-1A细胞侵袭能力的比较:体外transwell小室侵袭实验显示,siRNA组穿膜细胞数为(143±13)个,明显少于空载体组和空白对照组[分别为(238±26)和(227±18)个,P<0.05];而空载体组与空白对照组比较,差异则无统计学意义(P=0.411)。4、顺铂对子宫内膜癌HEC-1A细胞YKL-40基因降低前后细胞生长的影响:加入不同浓度梯度的顺铂培养细胞48h后,细胞的生长明显抑制,实验组细胞(转染siRNA后)比空白对照组和空载组细胞生长抑制更显著(P<0.05),但空白对照组组和空载组无明显差异(P>0.05)5、顺铂处理前后对子宫内膜癌细胞中YKL-40表达的影响比较:经过相同浓度的顺铂处理子宫内膜癌后,子宫内膜癌中YKL-40基因的表达量上调(P=0.000)。6、经相同浓度顺铂处理各组细胞48小时3组HEC-1A细胞总凋亡率的比较:经过相同浓度的顺铂处理子宫内膜癌48小时后siRNA实验组的增殖能力低于空白对照组和空载组(P<0.05)。siRNA组、空载体组、空白对照组细胞总体凋亡率分别为(38.07±4.88)、(13.3±1.01)、(12.5±0.17),siRNA实验组的总体凋亡率高于空白对照组和空载体组,差异均有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和空载组无明显差异(P=0.776)。结论:siRNA沉默HEC-1A细胞中YKL-40基因表达可以降低HEC-1A细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且可以提高HEC-1A细胞对顺铂化疗的敏感性,经过顺铂处理细胞48小时后其凋亡率明显降低。因此,YKL-40具有促进子宫内膜癌细胞增殖、促进血管形成以及抗凋亡能力。YKL-40可能是未来子宫内膜癌分子治疗的潜在靶点。