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同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白(homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein,Herp)是HERPUD 1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1)基因编码的一种应激反应蛋白,其N-末端含有泛素样结构域(ubiquitin-like domain,ULD),在内质网早期应激中表达升高,可促进错误折叠蛋白的清除。在阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和脊萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等多种神经退行性疾病中,均出现错误折叠蛋白在内质网腔中聚集,引发ER应激(endoplasmic reticulum stress,ER应激)。在PD中,Herp因ER过度应激而表达升高,并通过泛素蛋白酶体途径增加CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)的降解,促进多巴胺神经元存活。亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)是一种常染色体显性遗传神经退行性疾病,由编码亨廷顿蛋白(huntingtin,Htt)的基因突变引起。HD基因的第一外显子中CAG重复序列异常增加,使其编码的突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin,突变Htt)含有超长多聚谷氨酰胺(polyglutamine,PolyQ)扩展片段。突变Htt错误折叠,以游离型和聚集型在细胞核和细胞质内广泛存在,产生细胞毒性,导致HD神经病理学损害。抑制突变Htt的形成或促进其清除对延缓HD的病理学进程具有重要意义。突变Htt可引起强烈的ER应激反应,诱发细胞凋亡;但此过程中内质网的一些定位蛋白表达升高,清除错误折叠蛋白,对细胞产生保护作用。Herp作为内质网定位蛋白,在HD中其mRNA水平显著增高,但Herp表达增高的意义不明。本研究利用HD转基因小鼠和表达突变Htt的N2a细胞在进一步检测突变Htt对Herp表达水平影响的基础上,分析了不同Herp表达水平对突变Htt降解和细胞毒性的影响及其机制。1.突变Htt上调Herp蛋白表达水平已有研究发现Herp的mRNA水平在突变Htt所引起的ER应激中显著增高,但并不明确其蛋白水平是否发生变化。因此,我们首先检测了HD模型小鼠和细胞中Herp的蛋白水平。免疫印迹分析显示,不同周龄(5周、8周和12周)的HD转基因小鼠R6/2小鼠脑中和瞬转突变Htt(Htt160Q-GFP)的N2a细胞中Herp水平较野生型小鼠和瞬转正常Htt(Htt20Q-GFP)的N2a细胞显著升高。免疫组织化学染色显示,在R6/2小鼠大脑皮质、纹状体和海马等脑区内,Herp的免疫反应性均较野生型小鼠显著增强。由此表明,突变Htt使Herp蛋白水平显著增高。2.Herp能与突变Htt相互作用为了解突变Htt上调Herp表达的意义,首先应用免疫荧光双标技术和免疫共沉淀实验分析了二者之间的相互关系。在共转染Htt160Q-GFP与Cherry-Herp的细胞中,表达游离型突变Htt的细胞内Herp弥散表达于胞核一侧的细胞质中,表达突变Htt聚集物的细胞中Herp空间定位发生改变并包裹在聚集物颗粒的外周。在单转染Htt160Q-GFP的细胞中,内源性的Herp也呈现出类似的变化特性。说明二者在空间上具有紧密关系。我们利用蛋白质免疫共沉淀方法对二者的相互作用进一步检测,结果发现Htt20Q与Htt160Q蛋白都可以免疫沉淀内源性Herp,但Htt160Q与Herp的相互作用更强。以上结果提示Herp与正常Htt和突变Htt都存在相互作用,但在Htt突变后Herp能选择性的增强与突变Htt的相互作用。3.Herp促进突变Htt降解并抑制突变Htt对caspase-3的激活为进一步了解Herp上调及其与突变Htt存在相互作用的意义,我们分别检测了过表达和沉默Herp后对Htt的影响。激光扫描共聚焦显微镜观察发现,在过表达Herp情况下,转染Htt160Q-GFP的细胞中GFP荧光强度减弱,含突变Htt聚集物的细胞数量明显减少;沉默Herp后,转染突变Htt的细胞中GFP荧光强度显著增加,含突变Htt聚集物的细胞数量明显增加。而在转染正常Htt(Htt20Q-GFP)的细胞内,过表达Herp仅使其GFP荧光强度略微减弱,但沉默Herp却可显著增强GFP荧光强度。免疫印迹检测发现,过表达Herp明显降低表达突变Htt的N2a细胞中聚集型和游离型突变Htt水平,而对正常Htt变化影响不显著;沉默Herp后,表达突变Htt的N2a细胞中游离型和聚集型突变Htt,以及表达正常Htt的N2a细胞中正常Htt水平均显著增加;免疫印迹检测还发现,过表达Herp在减少突变Htt的同时,还可显著减弱突变Htt对caspase-3的激活,沉默Herp在增加突变Htt的同时还增强突变Htt对caspase-3的激活。RT-PCR分析显示,过表达或沉默Herp对转染表达的突变或正常Htt mRNA表达水平无明显影响。由此表明,突变Htt上调表达的Herp可通过促进突变Htt的降解而减轻突变Htt的细胞毒性。过表达Herp对正常Htt水平无明显影响,表明Herp可选择性促进异常蛋白的降解。沉默Herp使正常Htt水平增高,说明生理水平的Herp对于维持细胞内正常蛋白的生理水平是必须的。4.Herp能促进游离型突变Htt经蛋白酶体途径被降解为了明确Herp通过何种途径促进突变Htt降解,我们对细胞内存在的两条主要的蛋白降解途径泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径分别进行阻断。应用溶酶体抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)阻断自噬途径后,过表达Herp造成的游离型和聚集型突变Htt的蛋白水平下降未出现明显改变。应用蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白酶体途径后,过表达Herp对游离型突变Htt的清除作用得到明显抑制,而聚集型突变Htt的蛋白水平未发生明显改变。结果提示Herp促进了游离型突变Htt经蛋白酶体途径的降解。5.Herp能增强突变Htt的泛素化Herp能促进游离型突变Htt通过蛋白酶体途径的降解,泛素化是蛋白经蛋白酶体途径降解的前提,为进一步证明Herp能否改变游离型突变Htt的泛素化,我们检测不同Herp表达水平对Htt160Q泛素化的影响。结果显示过表达Herp能增强Htt160Q的泛素化,而沉默Herp则减弱Htt160Q的泛素化。说明Herp能增强游离型突变Htt的泛素化促进其经泛素-蛋白酶体途径的降解。6.UBL是Herp抑制突变Htt异常聚集及促进突变Htt降解的关键结构域以上结果显示蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径抑制剂均未阻断Herp对聚集型突变Htt的减少作用,说明Herp不通过蛋白酶体途径对聚集型突变Htt产生清除作用,而可能通过其他方式直接影响聚集型突变Htt的水平。真核细胞内还存在分子伴侣介导的对突变Htt的解折叠现象,具有泛素样结构域或类泛素功能的蛋白可发挥分子伴侣样的作用调节底物的装配。为证明含有UBL结构域的Herp是否发挥分子伴侣样的作用抑制突变Htt聚集物的形成,我们构建Herp的UBL结构域缺失质粒(HA-Herp-△UBL)。发现与HA-Herp相比较,HA-Herp-△UBL对游离型突变Htt的减少作用略微减弱,而对聚集型突变Htt的减少作用显著减弱。说明UBL结构域参与了Herp抑制突变Htt异常聚集及促进突变Htt降解的过程,是Herp发挥功能的关键结构域。结论:本研究发现突变Htt可上调Herp蛋白水平并与其存在相互作用,这种上调的Herp可通过增加游离型突变Htt的泛素化来促进其经泛素蛋白酶体途径的降解,同时可能通过分子伴侣样作用抑制聚集型突变Htt的形成,减少了细胞内突变Htt蛋白的含量,从而减弱突变Htt的细胞毒性,对细胞起到保护作用。