[研究背景]中枢性性早熟(central precocious puberty,CPP)是指由于下丘脑-垂体-性腺轴的提前启动,女孩在8岁前,男孩在9岁前出现第二性征发育的儿童内分泌疾病。2010年中国九大城市女童第二性征发育和初潮年龄调查显示:女童在8岁前出现乳房发育者超过10%,而10岁前月经来潮者占1.65%。研究表明,性早熟不仅会造成矮身材,影响儿童的正常发育和社会心理健康,还会导致成年后乳腺癌、子宫内膜癌、肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等的发病风险显著增高。因此,儿童性早熟的早期诊断和及时干预,不仅可以使青春发育回归正常的生理过程,还可以减少后期相关疾病发生的风险。青春期启动时间受遗传、环境、种族、营养及社会经济等多方面因素影响,其中遗传因素起到关键性作用。到目前为止,已证实的与CPP相关的致病基因有KISS1、KISS1R、DLK1和MKRN3基因。其中MKRN3基因所致性早熟发病率相对较高,自2013年在新英格兰杂志首次报道以来,目前已有多个家系及散发病例被发现。[研究目的]1.从遗传和基因方向入手,通过检测和分析CPP患儿中MKRN3基因的突变类型和遗传方式,探讨MKRN3基因在中国CPP患儿中的突变规律。2.通过研究不同MKRN3基因突变所对应的临床表型,明确基因型与表型的关系,为CPP患儿的精准诊疗和遗传咨询提供理论依据。[研究设计与方法]1.选取研究对象:选取2015.02-2017.02在江苏省苏州大学附属儿童医院内分泌科就诊及住院的CPP患儿173例(其中9例为家族性CPP),早青春期患儿43例(其中3例有家族史)为研究对象。CPP诊断参照2015年中华医学儿科学分会内分泌遗传代谢学组发表的《中枢性性早熟诊断与治疗共识》,排除误服避孕药,颅内、盆腔、肾上腺等部位的占位性病变和其他内分泌疾病(如Mc Cune-Albright综合征)引起的性早熟。2.研究内容:收集所有患儿的临床资料,包括就诊年龄、发病年龄、骨龄、初诊时第二性征分期、性腺大小、促性腺激素释放激素(Gn RH)激发试验、家族性CPP患儿的家族史等;在征得患儿及其家属同意后,同时采集血样标本。提取血液组织全基因组DNA,用PCR法扩增MKRN3基因片段,纯化PCR产物,用Sanger法进行测序。依据“ACMG基因变异解读指南”,运用多种计算机软件及数据库,对MKRN3基因新突变的致病性进行分析,探索MKRN3基因型与CPP临床表型的相关性。3.研究方法:(1)DNA的提取:采用商品化试剂盒(TIANamp Blood DNA试剂盒,天根生物科技,中国北京),按照说明书方法提取基因组DNA,并对其浓度进行标化。(2)PCR法扩增MKRN3基因:用PCR法扩增MKRN3基因整个编码区,将其扩增为三个重叠的片段(三对引物序列分别为:CCGGAAGTAGGTAGGAACACAC和TTCAGCAGCCGAGCCAATCA;CTTTCTGGTCGGAAGATGGC和CACCTGCGGATACACCTAAT;TGCAGCGTGGTATGGACAAG和AGAAGCACTGCCTCAACAGC)。纯化PCR产物。(3)Sanger法测序:用ABI3730xl系统对PCR产物进行分析,并与参考序列进行比对,参考序列由Ensembl数据库获得(版本序列号ENST00000314520)。家系患儿若发现突变,需在其三代以内直系亲属中进行突变位点验证。(4)新错义突变的致病性预测:用计算机程序(Poly Phen-2,SIFT,Mutation Taster等)对突变的致病性进行初步预测。(5)基因型与表型相关性分析:依据“ACMG基因变异解读指南”,同时运用多种计算机软件及数据库(如Ex AC Browser,1000Genomes,Clinvar,HGMD等),结合家系分离分析,明确基因变异的人群携带率、遗传方式,以及与临床表型的相关性。(6)新错义突变的生物信息学分析:运用计算机软件(BLAST/PSI-BLAST、MODELLER V9.19、VMD1.9.4)构建MKRN3蛋白的三维结构模型,并分析突变所处的空间位置,从而推断其对蛋白功能的影响。[研究结果]1.MKRN3基因测序结果:本研究在2个散发病例(散发共204个)和5个家系病例(家系共12个)中,检测出四种MKRN3基因突变,分别为:c.1138G>A(p.Glu380Lys)、c.1420T>A(p.Leu474Met)、c.673C>G(p.Leu225Val)、c.1071C>G(p.Ile357Met);其中第一个为新发错义突变(父母均无该突变),后三者则为杂合错义突变(父或母有相同突变)。以上4种突变,目前均无文献报道,为本研究发现的新的突变位点。2.MKRN3突变组和非MKRN3突变组的临床特征相比无明显差异。3.综合12个家系病例的基因及临床资料,进行遗传学分析提示:c.1138G>A(p.Glu380Lys)和c.1071C>G(p.Ile357Met)为CPP的可能致病突变;另外两个错义突变的临床意义均不明确。4.MKRN3突变对其蛋白结构及功能影响的生物信息学分析:E380K和I357M均位于锌离子结合区域(C3HC4环状锌指区),而前者由于E(带负电荷)突变为K(带正电荷),使得其物理化学性质完全改变,氨基酸之间的氢键相互作用无法形成,局部结构的稳定性被破坏,并可能导致锌离子结合障碍,故推断其对MKRN3蛋白功能的表达有显著影响。[研究结论]1.本研究中MKRN3突变所致CPP的发生率相对较低,女孩多见,以错义突变为主。2.MKRN3突变在家系及散发CPP病例中均可检测到,其遗传方式为常染色体显性遗传,有性别依赖的不完全外显率。3.基于MKRN3突变的印迹遗传模式,采集病史时不仅要了解母亲一方的家族史,更应详细询问父系家族史。有男性性早熟家族史的健康儿童,应早期进行遗传咨询,以免错过最佳诊疗时机。4.可在家族性CPP的患者中常规进行MKRN3基因检测。5.无论中国还是国外,Gn RH类似物都是MKRN3突变所致CPP的唯一可靠治疗手段。