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玫烟色棒束孢Isaria fumosoroseus是一种重要的昆虫病原真菌,其次级代谢产物几丁质酶在玫烟色棒束孢侵染害虫的过程中起到关键性的作用,也是目前微生物农药的研究热点之一。本研究内容主要包括以下几个方面: (1)研究了玫烟色棒束孢几丁质酶粗提取液(600 mU/mL)对小菜蛾拒食活性、生长发育和中位存活期的影响。结果显示:用几丁质酶粗提取液(600 mU/mL)处理小菜蛾二龄幼虫,处理组相对于对照组的二龄幼虫消耗叶片的比率降低了47%,24 h的非选择拒食率为39.29%,48 h为53.66%。幼虫的体重也在第五天达到最大差异值2.1 mg;而对于4龄幼虫处理显示,处理组相对于对照组的正常化蛹率降低了51%,成虫羽化率也降低了45%,中位存活期仅为1.7天。以上数据说明玫烟色棒束孢几丁质酶对小菜蛾有很好的防治效果,具有广阔的应用前景。 (2)利用RACE技术,克隆得到了玫烟色棒束孢几丁质酶基因的cDNA序列(命名为DBIfuchit I),Genebank登录号:JX100807.序列分析表明:DBIfuchit I基因的开放阅读框全长为1278 bp,编码425个氨基酸,具有几丁质酶18家族两个高度保守的活性区域SIGG结合位点和DGIDIDWE活性位点,预计蛋白质分子量为46.254 kD,等电点为5.99。其N末端存在一个由22个氨基酸组成的信号肽(signal peptide),去除信号肽的成熟肽玫烟色棒束孢DBIfuchit I蛋白有403个氨基酸,分子量为44.113 kD,等电点为5.59.DBIfuchit I蛋白为亲水性的可溶性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和β-折叠构成。利用生物学软件对玫烟色棒束孢DBIfuchit I氨基酸序列进行同源性分析,玫烟色棒束孢DBIfuchitI基因与粉质棒束孢Isaria farinosa几丁质酶基因的同源性最高,达到87%,结果表明玫烟色棒束孢DBIfuchit I基因属于几丁质酶18家族中新的一员。 (3)利用DNA步移法,克隆得到了玫烟色棒束孢几丁质酶基因的基因组DNA序列(命名为DIfuchit)。Genebank登录号:JX100806,序列分析表明:DIfuchit基因的全序列长度为3651bp。共含有三个内含子,大小分别为53 bp,54 bp和50 bp.三个内含子序列均符合GT-AG法则。预测结果显示,DIfuchit基因的启动子序列位于1454碱基至1506碱基处,大小为50 bp。其中转录起始位点是位于1496碱基处的A碱基。具有真核生物的基本启动子序列TATA-盒。DIfuchit同时含有多种CdxA、HSF(热激转录因子)等重要的转录因子结合位点,以及GATA、CCAAT等启动子顺式调控元件。 (4)利用农杆菌介导转化的方法,成功将构建的含潮霉素抗性基因和eGFP基因的真核表达载体转入到玫烟色棒束孢中,利用PCR和荧光检测筛选出了稳定的阳性转化子。