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课题一，TES基因高甲基化致脑胶质瘤细胞抗凋亡并与病人预后差相关 背景和目的:脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是人类最常见的脑肿瘤，是恶性度最高、进展最快、死亡率最高的脑肿瘤，平均生存期约为12-15个月，其发病的分子机制非常复杂，与其它一些常见的恶性肿瘤相似，基因组甲基化异常在脑胶质母细胞瘤中非常普遍，包括全基因组的低甲基化和一些肿瘤抑制基因的高甲基化，但这些基因组甲基化异常导致发病的原因，以及对病人的疗效和预后尚不明确。在该研究中，我们采用甲基化芯片的方法对脑胶质母细胞瘤基因组14475个基因启动子区进行筛查，以期得到一些甲基化状态异常并且与病人预后相关的基因，为脑胶质母细胞瘤提供用于诊断和治疗的有效的靶基因。 方法:我们使用甲基化芯片的方法对42例原发性脑胶质母细胞瘤(pGBM)病人样本及8例正常脑组织样本的基因启动子区进行分析。采用免疫组织化学方法对另外37例pGBM病人样本和2例正常脑组织样本的TES蛋白表达进行分析。用去甲基化药物5-aza-dC处理脑胶质瘤细胞系U251，采用WesternBlot方法检测TES蛋白表达，用流式细胞术的方法检测细胞凋亡。 结果:与正常脑组织样本相比，pGBM病人样本中TES基因高甲基化，并且甲基化程度越高，病人预后越差(p＜0.05，log-ranktest);免疫组化结果发现，在所有37例pGBM病人样本中，有33例(89.2％)TES蛋白表达下调，并且蛋白表达下调与病人不良预后相关(p＜0.05，log-ranktest);用去甲基化药物5-aza-dC处理脑胶质母细胞瘤细胞系U251，可使TES蛋白表达明显上调，U251细胞凋亡率升高。 结论:研究证明在pGBM中TES基因启动子区高甲基化，在这些病人中TES蛋白表达普遍下调，启动子区TES基因高甲基化和组织中TES蛋白表达下调都与病人的临床预后差密切相关;采用去甲基化药物5-aza-dC处理脑胶质母细胞瘤细胞系U251，可使TES蛋白表达明显上调，并且显著促进U251细胞的凋亡率。这些结果证明，TES基因发挥抑癌基因的作用，并且可能成为pGBM病人预后的分子指标。 课题二，脑胶质瘤中DNMT3B不同转录本的筛查 背景和目的:脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)中存在广泛的基因组低甲基化与部分区域的高甲基化异常，这种异常几乎发生在所有肿瘤中，但发生的原因，机理以及对肿瘤的发生，发展和对病人的疗效和预后的影响不明，研究肿瘤基因组甲基化异常发生的机制和肿瘤发生与疗效的影响具有重大的理论与临床诊断和治疗意义。DNA甲基化是由DNA甲基化酶1、3A、3B(DNAmethyltransferase1、3A、3B)所介导的，最近发现在AML等肿瘤中DNMT3A突变，但这种突变在AML中约占20％病例，在脑胶质瘤中没有报道，在其它肿瘤中也很少见，不能回答基因组广泛低甲基化的原因。本研究初步检查了DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)在这种肿瘤中的突变情况，以期寻找肿瘤基因组低甲基化发生的原因。 方法:用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒从25例多形性脑胶质母细胞瘤组织中提取总RNA，用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增DNMT3B的cDNA，然后测序，所得序列经DNASTAR软件与NCBI发表的正常序列进行比对。 结果:我们从25例脑胶质母细脆瘤样本中成功扩增了全长DNMT3BcDNA，测序分析结果显示DNMT3B基因在该肿瘤样本中存在多种剪接变异体，以DNMT3BV1、DNMT3BV3、DNMT3BV7为主。没有发现改变氨基酸序列的点突变。 结论:DNMT3B基因在脑胶质母细胞瘤中没有点突变，但存在多种剪接变异体（以DNMT3BV3、DNMT3BV7为主），其是否为脑胶质母细胞瘤的广泛基因组低甲基化的原因尚有待进一步研究。