论文部分内容阅读
目的阿霉素(Doxorubicin,Dox)是一种广谱抗肿瘤药物,但因心脏毒性及高的耐药率使其应用受到了严重地限制。Dox除了对细胞核DNA有作用外,线粒体也是其主要靶点,线粒体作为真核细胞的重要细胞结构,在凋亡信号转导过程中起重要作用,而且线粒体中也含有功能性DNA,对抗肿瘤药物非常敏感。因此为了减少抗肿瘤药物对正常细胞的损伤,制备一种能够将Dox有效递送到肿瘤细胞线粒体的靶向载体,就显得极为重要。在本课题中,根据肿瘤细胞线粒体跨膜电位较高的特性,将具有线粒体高结合特异性的阳离子亲脂性化合物三苯基膦(TPP),连接到良好的药物载体壳聚糖纳米粒(CS-NPs)的表面,以肺癌A549细胞和宫颈癌Hela细胞作为肿瘤细胞模型,考察阿霉素-三苯基膦壳聚糖纳米粒(Dox-TPP-NPs)对肿瘤细胞线粒体的靶向作用,以及Dox-TPP-NPs的抗肿瘤活性。方法以阿霉素、壳聚糖、多聚磷酸钠、三苯基膦为原料,采用离子交联法,制备壳聚糖纳米粒(CS-NPs)、三苯基膦壳聚糖纳米粒(TPP-NPs)、阿霉素壳聚糖纳米粒(Dox-CS-NPs)和阿霉素-三苯基膦壳聚糖纳米粒(Dox-TPP-NPs),并通过红外光谱扫描对纳米粒结构进行鉴定。首先对制备的Dox-TPP-NPs进行处方优化,质量评价和表征分析;再对其靶向性进行初步研究,体外培养A549细胞和Hela细胞,采用激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞对游离Dox(Free Dox)和Dox-TPP-NPs的摄取以及Dox在肿瘤细胞内的分布情况,并对Dox的细胞内摄取进行定量分析;最后研究Dox-TPP-NPs的抗肿瘤活性,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测Free Dox和Dox-TPP-NPs的体外抗肿瘤效果,激光共聚焦显微镜观察JC-1染料发射荧光强度的变化,研究Free Dox和Dox-TPP-NPs处理后细胞线粒体膜电位的变化,并对细胞内活性氧(ROS)的产生情况进行定量分析,再通过Western Blot法考察了Free Dox和Dox-TPP-NPs对线粒体凋亡通路相关蛋白的调节情况。结果经红外光谱鉴定,成功将TPP连接至CS-NPs的表面,在对纳米粒的表征分析中,透射电镜图片显示Dox-TPP-NPs形态呈球形;平均粒径为100.1±4.3 nm,多分散指数为0.016,说明纳米粒分散性良好;Zeta电位为正值,大小为15.6±2.3mV;Dox-TPP-NPs包封率和载药量分别为91.3%和13.2%;体外释放实验表明Dox从Dox-TPP-NPs中持续释放,并且随着释放介质pH值的降低,药物累积释放量显著增加,促进了药物的快速释放。体外培养A549细胞和Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞对纳米粒的摄取在6小时内基本完成,肿瘤细胞与Free Dox共孵育时,Dox逐渐累积在肿瘤细胞核中,而在与Dox-TPP-NPs共孵育时,Dox均匀分布于细胞质,借助线粒体指示剂,证明纳米载体有效且特异地递送Dox进入肿瘤细胞线粒体中。通过MTT法测定Free Dox和Dox-TPP-NPs对肿瘤细胞的细胞毒性,两者能够呈浓度依赖性地抑制肿瘤细胞生长,并且Dox-TPP-NPs可以诱导更高的细胞抑制作用。激光共聚焦显微镜观察JC-1染料发射荧光强度的变化,结果表明Dox-TPP-NPs能够诱导Dox向线粒体的靶向递送,并且通过降低线粒体膜电位显著增强对肿瘤细胞线粒体的损伤。荧光定量分析肿瘤细胞线粒体中产生ROS的情况,结果表明,经Free Dox和Dox-TPP-NPs处理后,细胞中产生的ROS显著增加,与Free Dox相比较,Dox-TPP-NPs处理后的细胞中产生ROS的量更多,表明Dox-TPP-NPs具有更强的细胞杀伤力。最后,通过Western Blot法考察了Free Dox和Dox-TPP-NPs对线粒体凋亡通路相关蛋白的调节情况,结果显示,相对于Free Dox,包封相同浓度Dox的Dox-TPP-NPs处理后的细胞中更多的细胞色素C从线粒体释放到细胞质,并且凋亡相关蛋白Bax、Caspase-9和Caspase-3的表达水平显著增强,这表明Dox-TPP-NPs通过线粒体途径诱导肿瘤细胞发生凋亡。结论在本课题中,成功制备了一种新型的肿瘤细胞线粒体靶向纳米粒,包封阿霉素的三苯基膦壳聚糖纳米粒是结构均一的球形实体,粒径集中分布,表面带正电,体外溶出具有显著的缓释效果,稳定性好。通过激光共聚焦显微镜、MTT法和Western Blot法对阿霉素-三苯基膦壳聚糖纳米粒的靶向性和抗肿瘤活性进行了初步的研究,结果表明纳米粒具有线粒体靶向性,可将阿霉素特异性地递送至肿瘤细胞的线粒体,增加了其在肿瘤细胞线粒体的蓄积,并干扰线粒体呼吸链,产生较高的细胞毒性,在线粒体途径诱导显著的细胞凋亡效应,增强了阿霉素的抗肿瘤活性,有进一步研究的价值。