我们及其他课题组研究发现,肾精具有干细胞的内涵。本项目选取临床常用的四种代表性补肾药物淫羊藿、补骨脂、女贞子、何首乌的有效单体为研究对象,以柴胡的有效单体为非补肾药物对照,并以文献报道的诱导分化药维甲酸(RA)为阳性对照,观察其对小鼠胚胎干细胞(mESC)自我更新及不同胚层的分化的影响,并进行初步的分子机制探索。本项目从药物效应角度为“肾藏精与干细胞的关系”的命题提供部分实验依据。目的：1观察补肾中药单体淫羊藿苷(ICA)、补骨脂素(PSo)、齐墩果酸(OA)、二苯乙烯苷(THSG)对mESC自我更新和分化的影响。2探索上述中药单体对mESC作用的分子机制。方法：1.细胞培养、分组及药物干预：取对数期的mESC悬滴3天形成拟胚体后再悬浮培养2天,在第6天贴壁时加入中药单体进行干预。实验分为正常对照组、溶剂对照组(DMSO)、分化阳性对照组(RA)、补肾中药单体组(ICA、THSG、Pso、OA)及非补肾中药单体组(柴胡皂苷Sai),每组均设高、中、低3个浓度梯度。2. Alamar染色检测药物对mESC生长曲线和早期增殖的影响：取对数期mESC接种于96孔板,加入不同浓度的中药单体,Alamar检测不同时点的OD值。3.碱性磷酸酶(AP)染色检测补肾中药单体对mESC克隆效率的影响：取对数期mESC接种于96孔板,加入不同浓度的中药单体,AP染色,并在显微镜下分类计数。计数标准为每个克隆蓝紫色染色面积大于该克隆总面积的90%为未分化克隆,小于总面积20%为分化克隆,其余为混合型克隆。4.干性维持基因及不同胚层标志物的检测：采用RT-PCR, qPCR及蛋白印迹检测mESC干性维持基因Oct3/4、Nanog、Sox2,内胚层标志物Sox17,中胚层Brachyury、Nkx2.5和外胚层标志物Pax6。5.mESC调控相关LIF通路关键分子的检测：采用RT-PCR、蛋白印迹检测LIF信号通路的主要分子ERK1、C-fos、p38MAPK、C-jun, gp130、Stat3、JAK1、ERK5的水平。结果：我们首先观察到分化阳性对照药RA能显著抑制mESC早期增殖,降低未分化克隆数目并显著降低mESC干性转录因子Oct3/4、Nanog、Sox2表达,升高胚层分化标志物Brachyury、Pax6的表达,结果与文献报道一致,表明本实验系统稳定可靠。1.补肾药有效成份ICA、THSG、Pso及OA对mESC自我更新及胚层分化的影响：1)ICA能显著促进mESC克隆分化；显著降低Oct 3/4表达,升高Sox17、 Brachyury及Nkx2.5表达。2) THSG能显著促进mESC克隆分化；显著降低Oct 3/4表达,升高Sox17、 Brachyury表达。3)Pso能显著促进mESC克隆自我更新；显著升高Oct3/4、Nanog、Sox2表达,降低Brachyury表达。4)OA对mESC克隆数目及形态无显著影响,能降低Oct 3/4 mRNA表达,但对Oct 3/4蛋白表达无显著影响；OA对各胚层标志物表达均无显著影响。5)疏肝理气药主要成份Sai能促进Pax6表达,但对mESC克隆数目及形态无显著影响。2.ICA、THSG、Pso对mESC调控相关LIF通路关键分子的影响ICA显著降低LIF上游分子JAK1、gpl30表达,降低LIF下游转录因子stat3即其磷酸化水平；THSG显著降低LIF上游分子JAK1表达,降低下游分子gp130及转录因子stat3蛋白及其磷酸化水平；Pso显著升高LIF下游stat3蛋白磷酸化水平。结论综上所述,我们首次发现补肾药主要成分ICA及THSG可能通过抑制gp130/stat3信号通路以促进mESC早期向内、中胚层分化；Pso则可能通过促进stat3蛋白磷酸化以维持mESC干性。本研究为“肾藏精具有干细胞内涵”提供科学依据,并提示补肾药物对干细胞具有不同的效应和通路,为临床补肾中药配伍应用提供实验依据；此外本研究发现了中药单体ICA促mESC向内、中胚层分化,内胚层最终将向消化道、肝脏等方向,中胚层最终将向心脏、肾上腺皮质等方向分化,该发现有效的发掘了以淫羊藿为代表的补肾中药在再生医学胚胎干细胞研究领域中的潜在应用价值。