卫气学说源于《黄帝内经》,是中医学基本理论之一。《黄帝内经》对卫气的生成、运行和功能等进行了较为详尽的论述。作为机体阳气的一部分,卫气发挥着温养脏腑组织器官、充润肌肤、防御外邪的功能,与中医学说的“治未病”理论密切相关。所以,卫气学说一直是中医科研领域的重要研究内容,其基本思路多集中在卫气的来源、运行、功能及其临床应用等方面。近年来,伴随着现代医学科研技术的发展,一些学者开始尝试借助现代医学的研究手段对卫气学说进行深入研究,并提出了关于卫气本质的一系列学说:主要包括卫气的免疫学说,卫气的热代谢学说,以及卫气的神经-内分泌-免疫学说等。虽然研究者在很多方面获得的结果和归纳的结论从某种程度上促进了卫气学说理论体系的进一步完善,但目前卫气的研究仍仅着眼于单一功能探求卫气的本质,而忽略了从卫气的年、月、日的生理节律及慓疾滑利的运行特点探究其物质本性的方法,因而难以诠释卫气的实质;其次,有关卫气的研究主要涉及到诸如免疫器官、免疫细胞等方面,这些成果虽然为丰富和发展卫气学说起到了积极的促进作用,然而,从整体观念及卫气的主体功能来看,显然卫气其他功能的物质基础涉及较少且尚不深入,还应在一个整体而全面的层面上对卫气的物质基础范围进一步深入研究。代谢组学技术提供了这个方面的可能性。代谢组学(metabolomics/metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个新的分支,是系统研究病理生理刺激后代谢产物的变化规律,来揭示机体生命活动代谢本质的科学,是系统生物学的重要组成部分。它以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段,定性定量研究生物体的内源性代谢产物,分析生物体在不同状态下代谢指纹图谱的差异,获得相应的生物标志物群,从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态。代谢组学抛开体内纷繁复杂的生化分子互相作用和网络式代谢过程变化,对代谢的终端产物进行多元化综合分析,从整体上展示生物体内在的变化状态,避免了以往采用单一指标或少数几个指标研究某种病理和生理变化的片面性,与中医治疗疾病和用药的整体观念相吻合。我们前期的研究已经初步证实卫气的年节律变化的存在,而节律变化的内在原因尚不清楚,生物钟基因的研究深入提供了探讨该问题的可能。生物钟基因普遍存在于生物界,其作用在于产生和控制昼夜生物节律的运转。昼夜节律变化普遍存在于各种生物体,生物的多种生理、生化、行为过程中都表现出一定的昼夜节律特征。生物钟基因的发现和对其活动规律的揭示,使对生物昼夜节律的研究获得突破性进展。而生物钟相关的卫气年节律研究目前尚无相关报道。本试验运用现代时间生物学理论及其研究方法探索卫气的年节律性变化特征,为卫气相关疾病的临床治疗提供理论参考和实验依据。在哺乳动物中,生物节律主要包括Clock、Bmall、Per、Cry等在内的生物钟基因及其蛋白产物组成的自身调控反馈环路。本课题遵循整体观念和《内经》卫气理论的本意,依据卫气年节律的周期变化,在前期实验的基础上,依据自然界的年周期规律,在农历的春分、夏至、秋分和冬至四个时间点对大鼠胸腺进行代谢组学检测,并对血淋巴细胞进行生物钟相关基因表达测定,从而探讨卫气年节律变化的基因节律调节机制,寻找体现卫气年周期变化的小分子物质基础,推测在自然界年周期变化的时相下,生物钟相关基因与发挥防御机制的卫气小分子物质的联动调节机制。通过研究卫气的年周期变化及调节机制、探寻卫气的实质及物质基础,为中医临床卫气相关疾病的预防和诊治提供实验学支持。第一部分卫气节律的相关理论探讨目的:从相关文献中发掘卫气的节律性变化规律及相关物质基础方法:查阅和提炼文献,从卫气的生成来源、循行、功能、本质、有关节律、卫气理论的临床应用等角度,对卫气进行综合论述,为卫气的节律性研究提供理论支持。结论:目前卫气的现代研究大多忽略了卫气的年、月、日的生理节律及慓疾滑利的运行特点,对卫气的物质本质及节律的形成机制还缺乏整体而全面的认识和研究。第二部分 实验研究实验一基于胸腺代谢组学对正常SD雄性大鼠卫气年节律变化的研究目的:通过代谢组学的方法对春夏秋冬四季的SD大鼠的胸腺进行物质测定,找出四季都包括并且存在变化节律的物质。方法:SD雄性大鼠卫气虚模型组采用疲劳寒热交替刺激法制备,正常组给予常规饲养,每日灌服等量等温纯净水。分别于秋分日(2013年9月23日)、冬至日(2013年12月22日)、春分日(2014年3月21日)、夏至日(2014年6月21日的中午12:00左右,对秋分、冬至、春分、夏至四组大鼠(每组20只)断头取血,用液相色谱-质谱联用仪,对胸腺进行代谢物检测。利用主成分分析法(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法(partial least squares,PLS)对检测的数据进行统计分析。结果:春、夏、秋、冬四个季节中正常组与模型组具有明显差异的代谢谱变化,本研究在负离子模式下共获得5个主成分,累积R2X=0.803,如Table1.1所示。我们推测出c AMP(环磷酸腺苷)、Malic acid(苹果酸)、Homocarnosine(高肌肽)、Uridine(尿苷)、Cortisol(皮质醇)为体现卫气在不同季节变化规律的潜在标志物。结论:推测出c AMP(环磷酸腺苷)、Malic acid(苹果酸)、Homocarnosine(高肌肽)、Uridine(尿苷)、Cortisol(皮质醇)可能为代表卫气在不同季节变化的潜在标志物。实验二基于胸腺代谢组学对卫气虚SD大鼠代谢物变化及玉屏风干预效果的实验研究目的:运用代谢组学方法研究卫气虚SD大鼠经玉屏风颗粒干预的胸腺代谢组学特征,对发现的潜在卫气虚标记物进行反证,以明确其可靠性。方法:SD雄性大鼠卫气虚模型组采用疲劳寒热交替刺激法制备,治疗组给予玉屏分散颗粒溶液灌服,正常组给予常规饲养,每日灌服等量等温纯净水。分别于秋分日(2013年9月23日)、冬至日(2013年12月22日)、春分日(2014年3月21日)、夏至日(2014年6月21日)的中午12:00左右,对正常组、模型组和治疗组3组大鼠(每组40只)断头取血,用液相色谱-质谱联用仪,对胸腺进行代谢物检测。利用主成分分析法(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法(partial第二部分实验研究least squares,PLS)对检测的数据进行统计分析,并与正常组比较,反证玉屏散的治疗效果。结果:实验大鼠在处于卫气虚状态时苹果酸、环磷酸腺苷、高肌肽、皮质醇四种物质与正常组相比呈现降低趋势,尿苷与正常组相比呈现升高趋势,给予玉屏风颗粒干预治疗后卫气虚状态被打破,病理变化出现扭转,前两种物质又开始向正常组水平靠拢,尿苷也开始向正常组水平偏离,因此该实验反证了苹果酸、环磷酸腺苷和尿苷三种是卫气虚证的潜在标志物的可能性,高肌肽和皮质醇两种物质在给予玉屏风颗粒干预治疗后变化趋势不明显。结论:玉屏风颗粒干预后卫气虚证SD大鼠出现代谢谱的回归;苹果酸、环磷酸腺苷、尿苷在治疗后回调,反证了这三种物质作为卫气虚证潜在证候标记物的可靠性;纠正紊乱的氨基酸代谢及磷脂类代谢可能是玉屏风颗粒在分子层面治疗卫气虚证的作用机制之一。实验三生物种基因Clock、Bmall和Cry1在卫气虚SD大鼠及玉屏风干预效果的年节律变化的实验研究方法:分别在春分、夏至、秋分、冬至前2周将30只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组,SD雄性大鼠卫气虚模型组采用疲劳寒热交替刺激法制备,治疗组给予玉屏分散颗粒溶液灌服,正常对照组给予常规饲养,每日灌服等量等温纯净水。用RT-PCR法检测各个季节大鼠血淋巴细胞钟基因Clock、Bmall和Cry1表达。1与同节气正常对照组比较,相应模型组大鼠钟基因Clock表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与春分比较,正常对照组、模型组夏至、秋分、冬至钟基因Clock表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与夏至、秋分比较,正常对照组、模型组冬至钟基因Clock表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),而夏至、秋分钟基因Clock表达差异无统计学意义(P>0.05)。与同节气模型组比较,相应治疗组大鼠钟基因Clock表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2与同节气正常对照组比较,相应模型组大鼠钟基因Bmall表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与春分比较,模型组夏至、秋分、冬至钟基因Bmall表达降低,正常对照组秋分、冬至钟基因Bmall表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),而夏至表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。与夏至、秋分比较,正常对照组、模型组冬至钟基因Bmall表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),而夏至、秋分钟基因Bmall表达差异无统计学意义(P>0.05)。与同节气模型组比较,相应治疗组春分、冬至大鼠钟基因Bmall表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),而夏至、秋分钟基因Bmall表达升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。3与同节气正常对照组比较,相应模型组大鼠钟基因Cry1表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与春分比较,正常对照组、模型组夏至、秋分、冬至钟基因Cry1表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与夏至、秋分比较,正常对照组、模型组冬至钟基因Cry1表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),而夏至、秋分钟基因Cry1表达差异无统计学意义(P>0.05)。与同节气模型组比较,相应治疗组大鼠钟基因Cry1表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1卫气虚模型大鼠与正常大鼠血淋巴细胞钟基因Clock表达存在季节性节律变化,且两者变化存在关联性,玉屏风干预后大鼠钟基因Clock表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2卫气虚模型大鼠与正常大鼠血淋巴细胞钟基因Bmal1表达存在季节性节律变化,且两者变化存在关联性。玉屏风干预后春分、冬至大鼠钟基因Bmall表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),而夏至、秋分钟基因Bmall表达升高,但差异无统计学意义(P>0.05)3卫气虚模型大鼠与正常大鼠血淋巴细胞钟基因Cry1表达存在季节性节律变化,且两者变化存在关联性。玉屏风干预后与同节气模型组比较,相应治疗组大鼠钟基因Cry1表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。