目的:从桑黄子实体中提取多糖,优化提取工艺,对分离的粗多糖进行纯化,获得分子量均一多糖成分,并通过系列分析方法确证多糖结构,初步研究粗多糖抗肿瘤活性,为开发疗效确切、稳定可控、服用方便的现代制剂打下基础。方法:根据多糖易溶于热水的性质,先将桑黄子实体粉碎后,热水浸提,浸膏中含有多糖、小分子糖、蛋白等多种物质,经乙醇沉淀,除去大部分小分子糖与游离蛋白,并用高效液相色谱检测醇沉效果,糖含量测定选用硫酸-苯酚法。为尽可能充分提取子实体中的多糖成分并节省生产成本,根据单因素及正交实验选择最佳提取条件,以多糖得率为考察指标。由于多糖结构的复杂型,其微观结构的分析是研究工作的难点,从而限制了药物的临床应用。为了研究活性多糖的理化性质,需要首先经过一系列分离、纯化步骤得到均一多糖。本实验首先根据结合蛋白的多糖可以呈两性离子的特性,采用离子交换层析选择合适的洗脱条件分离多糖与蛋白多糖,进而利用分子筛原理经凝胶柱层析分别纯化所得多糖与蛋白多糖,层析过程中流动相带入的无机盐通过超滤除去。多糖为大分子化合物,它的纯度标准不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量。因为即使是多糖纯品,其微观也是不均一的。它的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均配布。我们通常所说的多糖纯品实质是一定分子量范围的均一组分。实验采用高效液相凝胶渗透色谱鉴定纯化效果并测定其分子量,以系列标准分子量葡聚糖为对照,根据其保留时间与分子量呈半对数线性关系得到所测样品的相对分子量。多糖含量采用硫酸-苯酚法,本实验尝试采用高温反应,迅速冷却,浓硫酸定容等改进方法,改善了目前多种报道方法中存在的稳定性差的缺点,使该测定结果相对稳定准确和可靠。PL-B在280nm处存在吸收,证明存在蛋白,实验筛选了常用的各种测蛋白含量方法,包括Lowry法,BCA法,Bradford法,得出的结果差别较大,最后选用校正的Lowry法,为考察样品中还原端基的多少,采用DNS法测定还原糖含量。多糖是多个单糖分子通过一定的链接方式组成的长短不一的复杂大分子,为测定糖链的糖基组成,需通过特定方法使糖链断裂,目前常用的检测方法有薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱。本实验结合以上三种方法确定两种样品中的单糖组成,其中薄层色谱对各种单糖的分离不是很好,但可以明显区别糖醛酸与各种单糖,PL-A,PL-B中均未显示糖醛酸;高效液相色谱可以较好的分离各种单糖,且样品处理简单,气相色谱样品需经衍生化处理,耗时较长。为测定PL-B中氨基酸组成,本实验采用对二甲氨基偶氮苯磺酰氯(DABS Cl)作为衍生试剂,用普通C18色谱柱通过HPLC测定PL-B中的氨基酸组成,相对于目前报道的分析蛋白多糖中所含的氨基酸种类方法(氨基酸分析仪或特定的离子交换柱通过HPLC分析)使用仪器常见,对于氨基酸定性测定重现性较好,但由于衍生导致样品进样量不易稳定,难以作为含量测定的方法。由于糖链结构的微观不均一性,使其构型研究比较复杂,需要多种现代技术与方法共同完成,目前常用包括物理学方法、化学方法、生物学方法。本课题选用红外光谱、核磁共振两种物理学方法及高碘酸氧化、Smith降解等化学方法分析桑黄多糖PL-A,PL-B的糖链构型。动物实验研究粗多糖的抗肿瘤活性,选用昆明种小鼠,建立S180小鼠肿瘤模型,随机分为5组给药。(1)安慰剂对照组:0.5%羧甲基纤维素钠灌胃;(2)阳性对照组:0.25%环磷酰胺皮下注射;(3)低剂量桑黄组:250mg/kg桑黄粗多糖灌胃;(4)中剂量桑黄组:500mg/kg桑黄粗多糖灌胃;(5)高剂量桑黄组:1000mg/kg桑黄粗多糖灌胃。考察各组荷瘤鼠瘤重及肿瘤生长抑制率,胸腺及脾脏指数,淋巴细胞转化实验,NK细胞功能。论文最后记录了对桑黄片剂的初步研究,主要包括辅料筛选及处方的初步设计,经质量检测基本符合要求。实验室下一步工作主要在此基础之上用科学方法优选处方,并选择合适包衣材料进行包薄膜衣,因为常用的包衣材料为纤维素类,与多种辅料一样会影响多糖的含量测定,目前报道有采用欧巴代薄膜对多糖类药物进行包衣,实验室正计划研究其性质与效果。结果:实验研究表明,按照L9(34)正交表进行的三因素三水平正交实验设计确定的桑黄粗多糖最佳提取工艺为:固液比1:15,浸提时间8小时,浸提温度100℃,在此条件下提取三次。用终浓度80 %乙醇沉淀,粗多糖得率为3. 26 %。通过对粗多糖分离纯化,分别得到相对分子量约为1.42×104和2.22×104的多糖PL-A和蛋白多糖PL-B;PL-B中糖占71%,蛋白占6.3%;PL-A,PL-B均含大量葡萄糖及少量甘露糖,PL-B中还有部分鼠李糖;PL-B所含氨基酸包括缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸;两者都是具有β-(1→3)-主链结构的复杂杂多糖。关于多糖的抗肿瘤活性与结构的关系是目前多糖研究的薄弱环节,大多还是科学家们分析和推测。根据已有的研究,Kawagishi等人得出只有具有β-D-葡聚糖结构的多糖具有抗肿瘤活性;马红樱等人得出从菌体中提得的活性多糖一般由葡萄糖组成,且必须具备葡聚糖主链上的β- (1→3)糖昔键和支链上的β- (1→6)糖昔键;本课题对桑黄多糖结构的研究结构与这些推论相吻合。药效学实验结果表明桑黄多糖能有效抑制小鼠S180实体瘤,对荷瘤小鼠细胞免疫功能方面的影响表现为明显的促进作用。粗多糖制成的片剂在片重差异、溶出度等方面均符合要求。结论:从桑黄子实体中提取的多糖成分有明显抗肿瘤活性,经纯化所得两种多糖PL-A与PL-B为未见报道的新的成分,具有进一步研究价值和很好的开发前景。