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核因子-κB是重要的转录调节因子,在炎症、衰老、肿瘤等生理病理过程中起到重要的调节作用。众多的肿瘤细胞中均发现有NF-κB持续性活化的存在,并且通过抑制NF-κB活性的策略能够起到抑制肿瘤生长、转移的作用,所以以NF-κB作为靶点的抗肿瘤策略受到了学术界的广泛关注。前期,通过酵母双杂交技术和生物信息学分析我们已经合成筛选出与NF-κB p65亚基竞争性结合的多条多肽,耦合穿膜肽形成p65穿膜结合多肽。在此基础上,经过筛选和不断改构得到一种不需要穿膜肽即能进入细胞的六肽分子HP-10。本实验旨在针对HP-10的抗结肠癌LoVo细胞增殖活性和细胞内转导能力进行体内外研究。主要研究方法和结果1. HP-10对结肠癌LoVo细胞增殖影响的体外实验用MTT实验观察HP-10对体外培养LoVo细胞的增殖抑制作用。多次重复的结果显示75μmol/L、37.5μmol/L、18.75μmol/L HP-10对LoVo细胞均有显著的抑制作用,且呈剂量依赖性抑制(P<0.05)。将标记有FITC的HP-10与LoVo细胞共培养2小时,用激光共聚焦荧光显微镜观察HP-10在体外的细胞穿膜功能。结果发现,与LoVo细胞共培养2小时,HP-10就能进入到细胞内发挥作用。在此基础上,进一步采用流式细胞仪技术检测HP-10对LoVo细胞生长周期和细胞凋亡的影响。HP-10并不能影响LoVo细胞周期变化,却促进LoVo细胞凋亡发生。2. HP-10对结肠癌LoVo细胞裸鼠皮下移植瘤模型生长影响的体内实验皮下注射LoVo细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型。给予不同浓度的HP-10隔日瘤内注射,共治疗7次;观察750μmol/L、375μmol/L、75μmol/L HP-10对裸鼠肿瘤生长抑制作用。和PBS和未治疗对照组相比,瘤内注射HP-10能显著抑制肿瘤生长(P<0.05),但在75~750μmol/L的浓度范围内未表现明显的浓度依赖性。将标记有FITC的HP-10进行瘤内注射2小时后,用激光共聚焦荧光显微镜观察HP-10在体内的细胞穿膜功能。HP-10能够穿透细胞膜进入肿瘤组织细胞内发挥作用。提取肿瘤组织细胞核蛋白,用ELISA法检测胞核中p65活性,以观察HP-10对NF-κB的抑制作用。和PBS治疗组和未治疗组相比,HP-10治疗组肿瘤组织的细胞核内NF-κB活性均降低(P<0.05)。用TUNEL法检测HP-10对肿瘤组织细胞凋亡的影响。发现药物治疗后肿瘤组织细胞凋亡率和对照组相比明显增加(P<0.05)。用Western blot方法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase 9前体蛋白、Caspase 8前体蛋白、Caspase 3前体蛋白五种凋亡相关蛋白的表达情况。结果发现,pro-Caspase 8、9、3三种前体蛋白和凋亡抑制因子Bcl-2表达均降低,而Bax凋亡促进蛋白表达增加。这说明,HP-10所诱导的肿瘤组织LoVo细胞凋亡是通过内源性和外源性两种途径产生的。结论HP-10是一种无需穿膜肽引导可直接进入细胞的寡肽,在体内外对LoVo细胞具有明显的抑制生长作用,这种作用是通过抑制NF-κB活性进而诱导细胞凋亡产生的。