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本研究分为二部分:
第一部分:PrxⅡmRNA及蛋白在小鼠卵巢中的表达模式
目的:探讨Peroxiredoxin Ⅱ(PrxⅡ)mRNA及蛋白在小鼠卵巢中的表达模式。
方法:选择不同发育时期C57BL/6J小鼠卵巢,运用免疫组化SP染色法、免疫印迹实验(Western Blot)、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测不同发育时期卵巢组织中PrxⅡ蛋白、mRNA的表达水平。
结果:PrxⅡ蛋白在各级卵泡的卵母细胞及颗粒细胞中均有表达,颗粒细胞其表达水平随卵泡发育而逐渐增强。始基卵泡与初级、次级、窦状卵泡相比,其卵母细胞及颗粒细胞中PrxⅡ蛋白表达水平明显低,具有统计学差异(P<0.05)。初级卵泡分别与次级、窦状卵泡相比其颗粒细胞中PrxⅡ蛋白表达水平较低,差异具有显著性(P<0.05)。闭锁卵泡的PrxⅡ蛋白呈强阳性表达,明显高于生长卵泡中的表达水平。黄体及间质中亦见少量PrxⅡ的表达。PrxⅡmRNA在卵巢组织中的表达水平随小鼠的生长发育无明显改变。3周,6周,11周小鼠卵巢中PrxⅡmRNA及蛋白表达水平不具有统计学差异(P>0.05)。
结论:PrxⅡ表达于小鼠各个年龄阶段及卵泡的不同发育阶段,在卵泡发育后期和闭锁卵泡中强表达,提示PrxⅡ在卵泡的生长发育及闭锁过程中可能发挥重要调控作用。
第二部分:PrxⅡ对颗粒细胞增殖、凋亡的作用及机制探讨
目的:探讨RNAi特异性沉默PRX2基因对颗粒细胞增殖、凋亡影响及作用机制。
方法:采用小片段干扰RNA(siRNA)沉默PRX2基因在颗粒细胞细胞中的表达,沉默效应通过Real-Time PCR和Western Blot验证。MTT比色法、流式细胞技术分析PrxⅡ基因表达下调对颗粒细胞增殖、凋亡的影响及Hoechst 33342试验检测细胞凋亡形态学改变。DCF探针检测PRX2基因表达下调颗粒细胞过氧化氢产生。Western Blot检测干扰PrxⅡ蛋白表达后对NF-κB表达影响。
结果:靶向PrxⅡ的siRNA转染48小时后检测效应,结果显示可有效封闭颗粒细胞中PrxⅡmRNA与蛋白的表达,表达降低至对照40[%],封闭使细胞内过氧化氢产生增加至正常对照组2倍,Si-PrxII可抑制细胞增值,促进细胞凋亡,与未转染及转染阴性对照siRNA的GC凋亡率9[%]、11[%]相比,转染PrxII siRNA 72h后,GC凋亡率增加至35[%]。Si-PrxII亦可减弱颗粒细胞清除外源性过氧化氢能力。随着凋亡的增加,NF-κB表达水平亦增加。
结论:PrxII可能通过调节颗粒细胞的凋亡发挥调节卵泡闭锁进而延迟卵巢衰老的作用。