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第一部分mTORC2/mTORCl抑制剂诱导MDS/AML细胞发生自噬性死亡目的:探索mTORC1/mTORC2抑制剂对骨髓增生异常综合征转化急性髓系白血病(MDS/AML)细胞增殖的影响,并从凋亡和自噬两方面进一步探讨抑制细胞增殖的作用机制。方法:本研究以人骨髓增生异常综合征(MDS)转化的急性髓系白血病细胞株SKM-1细胞株为研究对象,采用CCK-8法检测不同浓度的雷帕霉素和mTORC2/mTORC1抑制剂OSI-027分别作用于SKM-1细胞后检测其细胞活性,流式细胞术检测对细胞周期的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测凋亡细胞比例,进一步利用Western-blot法检测PARP蛋白的活性分析来验证细胞是否发生凋亡;利用透射电镜观察细胞内自噬泡及自噬小体;吖啶橙染色法流式检测酸性自噬泡数量;利用自噬抑制剂氯喹联合OSI-027处理细胞后用Annexin V-FITC/PI流式检测细胞凋亡比例和CCK-8法检测增殖活性;RT-PCR法检测自噬相关基因Beclin-1和LC3B的mRNA表达量;Western-blot法检测Beclin-1和LC3的蛋白表达水平变化。结果:mTORC2/mTORC1抑制剂OSI-027比mTORC1抑制剂雷帕霉素显示更有效的抑制SKM-1细胞的增殖;OSI-027将SKM-1细胞周期阻滞于G0/G1期;经流式检测凋亡细胞比例和PARP蛋白的活性分析,结果表明OSI-027诱导的凋亡细胞比例与对照组无统计学差异,Western-blot结果显示经OSI-027处理后并未使得PAPR发生明显的水解断裂条带;而用电镜观察OSI-027处理后的细胞发现,胞质内出现大量的自噬空泡和自噬小体,用吖啶橙染色流式检测酸性自噬泡的比例明显增多;利用自噬抑制剂阻断自噬后,进一步用OSI-027处理细胞后检测Annexin V-FITC/PI流式检测细胞凋亡比例结果显示,阻断自噬后并不能提高细胞凋亡比例,CCK-8法检测细胞增殖活性发现,自噬抑制剂可部分解救OSI-027造成抑制增殖作用;OSI-027处理细胞12h后经RT-PCR检测自噬相关的基因Beclin-1和LC3B表达增加,与未处理组有明显的统计学差异;经Western-blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显增加。结论:mTORC2/mTORC1抑制剂OSI-027能有效抑制SKM-1细胞增殖,且主要是通过诱导SKM-1细胞发生自噬性死亡的机制抑制其生长增殖。第二部分mTORC2/mTORC1抑制剂诱导MDS/AML细胞发生自噬性死亡的机制研究目的:通过OSI-027与雷帕霉素干预MDS/AML细胞株SKM-1细胞,研究mTORC2/mTORC1抑制剂诱导MDS/AML细胞发生自噬性死亡的分子机制研究。方法:OSI-027与雷帕霉素处理MDS/AML细胞株SKM-1细胞后,Western-blot检测细胞中p-mTOR ser2448, p-mTOR ser2481, p-P70S6K, P70S6K, p-4E-BP1Thr37/46,4E-BP1, p-Akt ser473, Akt, p-FOXO3a Thr32, FOXO3a的表达;免疫共沉淀(co-IP)法检测4E-BP1与eIF4F和eIF4G蛋白质问的相互作用。结果:在SKM-1细胞中p-mTOR ser2448和p-mTOR ser2481的高表达,雷帕霉素能特异下调p-mTOR ser2448表达,但不能下调p-mTOR ser2481的表达,OSI-027可以同时有效抑制这两个位点磷酸化蛋白表达;OSI-027和雷帕霉素都能有效抑制mTORC1信号通路下游分子p-P70S6K的表达。OSI-027能明显下调p-4EBP1Thr37/46的表达,而雷帕霉素在高浓度下也不能下调其表达。免疫共沉淀结果表明OSI-027能有效下调4E-BP1与eIF4F和eIF4G蛋白质结合,进而阻断cap依赖性的mRNA翻译过程。雷帕霉素处理细胞后p-Akt ser473表达增强,FOXO3a, p-FOXO3aThr32表达无明显变化;相比之下,OSI-027处理细胞后p-Akt ser473表达明显下调,FOXO3a表达上调,p-FOXO3aThr32表达明显下调。结论:雷帕霉素能特异抑制mTORC1激酶后,可持续上调p-Akt ser473的表达。OSI-027可以有效抑制mTORC2信号通路激活,下调Akt ser473的表达,下调转录因子FOXO3a在Thr32磷酸化蛋白表达,从而诱导SKM-1细胞发生自噬。