论文部分内容阅读
自然流产占全部妊娠的10%-15%,由遗传、免疫、感染、解剖、内分泌、环境等因素引起,遗传因素中的染色体异常占所有自然流产的50%～60%。染色体异常分为数目异常和结构异常,约86%为数目异常,结构异常仅6%,包括嵌合型在内的其它异常占8%。染色体异常可能源于配子生成前的有丝分裂、配子生成的减数分裂或受精卵最初几次有丝分裂,是自然流产、出生缺陷的主要原因。人体的所有细胞均来源于两个单倍体配子形成的受精卵,即：配子的染色体异常可导致所有的子代细胞染色体出现异常；卵裂早期部分细胞出现染色体异常可导致嵌合型,而且发生越早,受影响的子细胞越多。因此,在配子生成、受精和卵裂过程中维持基因组的完整性对于人类胚胎正常发育至关重要。单个受精卵发育成一个由多种细胞、组织和器官组成的个体是通过细胞增殖周期实现的。细胞周期分为G1、S、G2和M期(前、中、后和末期),是在多个检验点的严格监控下、由一系列连续事件按精确时间顺序进行的动态过程,其中纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint,SAC)主要作用是监控细胞分裂中期所有染色体与纺锤体微管正确连接并排列在细胞赤道面上,细胞方能进入分裂后期,保证染色体能够精确地分配到子细胞中,防止子细胞染色体出现数目异常,以维持基因组的完整性。MAD2、BUB1编码的蛋白是SAC主要成份。MAD2作用是结合MAD1并被募集到动粒,随后发生构象改变,转变成C-MAD2后,与Cdc20、BUBR1、BUB3形成有丝分裂检查点复合物(mitotic checkpoint complex,MCC),MCC与后期促进复合物(anaphase promoting complex,APC/C)相互作用并抑制其泛素连接酶活性,使其不能靶向降解securin(人类为hPTTG)和cyclin B,细胞不能进入分裂后期,以提供时间改正不正确的动粒-微管连接,防止染色体分离错误。BUB1是结合BUB3的蛋白激酶,有三个主要区域：N末端保守区域作用是定位动粒；非保守区域作用是结合BUB3；C-末端区域作用是催化丝氨酸/苏氨酸激酶。BUB1对于细胞分裂中期染色体中板集合是必须的,具体作用：建立并/或维持有效的纺锤体微管双极连接；监控微管连接到动粒；募集MAD2、BUBR1和着丝粒相关蛋白CENP-E、CENP-F蛋白到动粒；通过Shugoshin保护姐妹染色单体的Cohesion,防止姐妹染色单体过早分离。近年来,SAC在染色体分离中的作用对于阐明胚胎染色体异常以及在肿瘤生成中的作用成为细胞生物学研究的热点,但SAC在人类早期胚胎发育及染色体异常中的作用鲜见报道。本研究采用FISH技术,选用13、16、18、21、22、X、Y染色体特异性探针,检测自然流产胚胎染色体数目是否异常,将自然流产胚胎分为染色体数目正常组和异常组,应用RT-PCR和Western-blot方法检测自然流产胚胎组织MAD2、BUB1mRNA及其蛋白的表达,探讨其在人类胚胎染色体分离中的作用。目的通过检测MAD2、BUB1mRNA及其蛋白在自然流产胚胎染色体数目正常组、异常组中的表达,探讨其在人类胚胎染色体分离中的作用。材料与方法1研究对象病例来源于郑州大学第三附属医院妇产科2010年6月至2011年1月因先兆流产或超声发现胚胎停育而就诊的99例自然流产患者,应用FISH技术将其分为染色体数目异常组和正常组。2实验方法2.1标本采集与处理清宫术后挑取绒毛组织,部分组织按照FISH检测要求进行标本处理,其余绒毛组织迅速冷冻后置-80℃冰箱用于RT-PCR和Western-blot检测。该实验经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准,留取标本时,均征求患者同意并签署知情同意书。2.2FISH检测自然流产胚胎绒毛组织染色体数目2.2.1标本处理无菌挑选自然流产胚胎新鲜绒毛组织5～10mg,生理盐水冲净血液和粘液,眼科剪剪碎后低渗,固定,冰醋酸消化,离心后弃上清液,滴片。2.2.2FISH检测滴好的标本片经胃蛋白酶消化后置74.5℃变性液5min,-20℃预冷乙醇梯度脱水,将10μl探针加于标本片杂交区域,封片后置湿盒42℃恒温培养箱中杂交过夜。暗室中将标本片依次置预热的50%甲酰胺/2×SSC溶液、2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,经70%乙醇脱水,自然干燥后滴加10μl DAPI复染剂,荧光显微镜下观察结果。2.3RT-PCR检测自然流产胚胎绒毛组织MAD2、Bub1mRNA的表达引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取胚胎绒毛组织总RNA,将RNA逆转录为cDNA,进行RT-PCR扩增,产物经15g/L琼脂糖电泳(溴化乙锭染色)后,采用凝胶成像仪扫描,结果取目的基因与β-actin基因灰度值的比值,作为MAD2、BUBl mRNA相对表达量。2.4Western-blot检测自然流产胚胎绒毛组织MAD2、BUB1蛋白的表达RIPA裂解法提取组织总蛋白,BCA法测定提取的蛋白质总浓度。Western-blot检测自然流产胚胎绒毛MAD2、BUB1蛋白的表达,以目的蛋白与β-actin蛋白相对灰度比值代表被测基因蛋白相对表达量。3统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行统计处理,两组间孕妇孕周的比较采用校正t检验,两组间孕妇年龄、孕次、自然流产次数采用Mann-Whitney U检验,孕周与胚胎染色体异常率比较采用校正χ2检验,自然流产次数与胚胎染色体异常率采用Kruskal Wallis检验,计量数据以x±s表示,两组间MAD2、BUB1表达量比较采用t检验,以a=0.05作为检验水准。结果1一般资料99例自然流产患者年龄21～41岁,孕周6-16周,孕次1-9次,自然流产次数1-4。应用FISH技术将自然流产胚胎分为染色体数目异常组(49例)和正常组(50例)。染色体数目异常组孕妇孕周(10.3±2.0)、年龄(30.0±4.9岁)、孕次(2.7±1.7)以及流产次数(1.4±0.6)与正常组孕妇孕周(10.2±2.5)、年龄(28.2±4.4岁)、孕次(2.1±1.2)以及流产次数(1.4±0.6)相比均无统计学差异(t=-0.101,P=0.92；Z=-1.881,P=0.06；Z=-1.852,P=0.06；Z=-0.226,P=0.82)。2自然流产胚胎绒毛组织中MAD2、BUB1mRNA相对表达量异常组胚胎绒毛组织中MAD2mRNA相对表达量为0.89±0.19,明显高于正常组的0.79±0.21(t=-2.317,P=0.023)；异常组胚胎绒毛组织中BUB1mRNA相对表达量(1.04±0.23)高于正常组(0.97±0.25),但差异无统计学意义(t=-1.333,P=0.186)。3自然流产胚胎绒毛组织中MAD2、BUB1蛋白相对表达量异常组胚胎绒毛组织中MAD2蛋白相对表达量为0.46±0.06,明显高于正常组的0.42±0.08(t=-2.373,P=0.020)；异常组胚胎绒毛组织中BUB1蛋白相对表达量(0.35±0.05)高于正常组(0.33±0.07),但差异无统计学意义(t=-1.510,P=-0.134)。结论MAD2在胚胎染色体数目异常组中高表达,延长了SAC的有丝分裂阻滞持续时间,在保证染色体正确分离,维持基因组稳定方面起重要作用。BUB1位于SAC激活后级联反应的上游,在延长有丝分裂阻滞时间中不起主要作用,但其正常表达对于SAC发挥功能必不可少。