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造血系统发育是造血干、祖细胞分化为各种功能性血液细胞的精密调控过程。在造血发育过程中,转录因子发挥着重要功能。其中,KRAB型锌指蛋白(KRAB-ZFPs)是最大的转录因子家族之一。该类基因是人类染色体转位引起恶性疾病的候选基因,其在形态发生与发育过程中起着重要的作用。例如：HPF4、HTF10与HTF34基因在髓系发育过程中下调；KID1基因在鼠的肾脏中表达具有时空特异性；AJ8基因则在胚胎胫骨与颅骨发育中起调控作用,并且过表达AJ8能够阻止破骨细胞发育。人KRAB-ZFPs基因ZNF300从3-5周龄人胚胎组织cDNA文库中克隆得到,其位于第5号染色体长臂末端5q33.1。在体外诱导胚胎干细胞往肝细胞与神经板细胞分化的过程中,ZNF300基因表达下降。ZNF300基因主要表达于5周龄人胚肝与胚心中,而5周龄人胚肝是人胚的主要造血组织之一,这提示ZNF300基因与造血系统发育相关。最近有报道指出,ZNF300基因与一种恶性血液疾病5q-综合症相关,该疾病是原发性骨髓细胞增殖不良的一种特异亚型,且其存在第5号染色体长臂5q13-q33的间隙性缺失。上述数据提示,ZNF300基因在血液细胞的发育过程中起重要的作用。基于以上数据,本研究致力于探讨ZNF300基因在髓系白血病与造血分化过程中的调控作用。为了系统地探讨ZNF300基因在血液细胞发育过程中的作用,首先,我们收集了34例成年急性髓系细胞白血病(AML)与慢性髓系细胞白血病(CML)患者的骨髓涂片。免疫组化实验显示,ZNF300基因在中晚幼粒细胞及单核细胞中高表达,在早幼粒细胞及成熟粒细胞中低表达,而在原始幼稚粒细胞中检测不到表达。这一现象不仅为临床诊断提供了潜在的分子标记,并提示该基因参与造血系统发育与白血病的发生发展过程。为进一步阐明ZNF300基因在髓系造血细胞发育过程中的调控机制,我们探讨了ZNF300基因的转录调控模式。首先,利用PCR方法克隆了ZNF300基因的5’端潜在的启动子区域,并对其进行功能性鉴定。引物延伸实验揭示了ZNF300基因的一个主要转录起始位点(TG(+1)CGGAA,定位于ZNF300基因的翻译起始位点ATG上游1733位)与若干次要转录起始位点。缺失突变实验表明,对ZNF300基因转录起调控作用的区域位于转录起始位点上游-624 bp到-333 bp。TESS在线程序预测该区域DNA序列上存在若干转录因子的结合位点,例如：C/EBPα、PU.1、c-Myb与AML等。定点突变实验显示,髓系特异转录因子——PU.1的结合位点(CTTCTC,-602 bp到-597 bp)突变后,ZNF300基因启动子活性显著下降,而C／EBPα、c-Myb与AML的结合位点分别突变后,ZNF300基因启动子活性没有明显变化。凝胶迁移率变化实验(EMSA)与染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分别从体外与体内水平验证了PU.1能够结合到ZNF300基因启动子上的PU.1结合位点。最后,过表达PU.1能够显著上调ZNF300基因的启动子活性,而沉默PU.1则能够明显地抑制ZNF300基因的启动子活性。以上结果显示,PU.1通过结合到ZNF300基因上游的PU.1结合位点对ZNF300基因起直接转录调控作用。为进一步探讨ZNF300基因在髓系造血分化过程中的作用,我们建立了HL60体外诱导分化模型,Western blot实验显示,ZNF300基因在DMSO或TPA诱导HL60分化过程中表达上调,并且PU.1的表达量也是同步上升。由于PU.1在髓系造血细胞发育早期起重要的作用,这提示ZNF300基因参与髓系造血系统的发育过程。综上所述,ZNF300基因在急性髓系细胞白血病与慢性髓系细胞白血病患者的骨髓组织中特异性表达,并且在髓系造血细胞发育过程中上调；ZNF300基因的表达是通过髓系特异的转录因子PU.1结合到ZNF300基因转录起始位点上游-602 bp到-597 bp的PU.1结合位点(CTTCTC)直接激活转录实现的；ZNF300基因与PU.1在HL60细胞的体外诱导分化过程中表达同步上升。以上结果表明,ZNF300基因在髓系造血细胞发育过程中发挥重要的功能；ZNF300基因的表达上升与白血病的发生发展过程有着密切的联系；ZNF300基因蛋白产物可能成为临床诊断的潜在分子标记或白血病治疗的候选靶标。