论文部分内容阅读
目的HTLV-1编码的癌蛋白Tax被认为是导致病毒感染后宿主细胞恶性转化的关键因素,本小组前期通过基因芯片分析稳定表达癌蛋白Tax的细胞系Tax P细胞,发现了10个高表达和38个低表达的基因,高表达基因中包括早期反应生长因子1(EGR1)。本研究旨在对Tax P细胞中EGR1的表达特性、生物学作用机制进行深入研究。方法1.EGR1在Tax蛋白阳性细胞中的表达(1)HTLV-1阳性T细胞中EGR1的表达选用HTLV-1阴性T细胞系Jurkat细胞、MOLT4细胞;HTLV-1阳性T细胞系MT2细胞和MT4细胞,western blot和real-time PCR检测EGR1 m RNA和蛋白的表达;(2)Tax蛋白对T细胞中EGR1表达的影响选用稳定表达Tax蛋白的细胞系Tax P及其对照细胞系Tax N,或者通过基因转染技术检测转染不同量的Tax质粒,western blot和real-time PCR检测EGR1 m RNA和蛋白的表达;(3)HTLV-1感染对宿主细胞EGR1表达的影响将HTLV-1阳性T细胞MT2与hela细胞或Jurkat按照1:5共培养,检测EGR1 m RNA和蛋白的表达。2.Tax蛋白阳性细胞中EGR1表达调控特性分析(1)构建不同长度的EGR1报告基因及其突变体以jurkat细胞基因组为模板,扩增EGR1调控序列全长993bp,构建Pgl3-EGR1-luc(E1),利用E1构建截短体E2(-423bp~+1bp)、E3(-223bp~+1bp);委托上海生工构建NFκB结合位点NBS(-422bp~-401bp)缺失和点突变的调控序列,分别标记为Del E和Mut E。(2)报告基因活性分析将不同长度的EGR1报告基因及其突变体,与参照载体Prl-luc和p65 sh RNA或对照载体共同转染Tax P细胞和MT2细胞,检测EGR1调控序列荧光素酶报告基因的相对活性。(3)HTLV-1感染对报告基因活性的影响将EGR1报告基因及其突变体,与参照载体Prl-luc和p65 sh RNA或对照载体共同转染hela细胞和jurkat细胞,转染结束后,加入1/5数量的MT2细胞,检测荧光素酶报告基因的相对活性。(4)染色体共沉淀检测p65直接结合EGR1调控序列收集MT2细胞,利用染色体共沉淀检测p65直接结合EGR1调控序列。3.p65介导的EGR1表达分析:(1)NFκB抑制剂BAY 11-7082对EGR1表达的影响在MT2细胞和Tax P细胞上清中加入BAY 11-7082或转染p65 sh RNA,检测EGR1和p65蛋白的表达(2)不同Tax突变体对宿主细胞EGR1表达的影响将Tax突变体M22、M47和野生型Tax,转染hela细胞,检测EGR1蛋白的表达;将EGR1荧光素酶报告基因分别与M22、M47和Tax转染293T细胞,检测EGR1调控序列活性。4.EGR1对HTLV-1感染细胞中RELA表达的影响及机制探讨将EGR1表达质粒电转Tax P细胞和MT2细胞,检测EGR1、p65蛋白;将EGR1表达质粒或转染Tax P细胞,观察EGR1对p65入核的影响;将EGR1表达质粒与NFκB荧光素酶报告基因p NFκB-luc共转Tax P细胞和MT2细胞,检测荧光素酶活性,或者提取核蛋白,利用凝胶电泳迁移率EMSA检测NFκB结合DNA的能力。5.EGR1促进HTLV-1感染细胞中NFKB活性机制探讨PHA和PBS刺激Jurkat细胞后加入蛋白合成抑制剂CHX,分别于不同时间段收集细胞检测EGR1蛋白的表达;将Tax质粒转染Jurkat细胞24h后加入CHX,检测EGR1和Tax蛋白的表达;利用免疫共沉淀技术,检测Tax P细胞中Tax和EGR1的直接作用。6.HTLV-1在Hela细胞中的复制动力学分析将HTLV-1阳性T细胞MT2按照1:1的比例加入Hela细胞,1h后反复吹吸去除悬浮细胞后,收集不同时间段的细胞,western blot检测核心抗原p19表达,real-time PCR检测病毒核酸拷贝。7.EGR1调控HTLV-1感染的机制分析(1)HTLV-1感染后对宿主细胞细胞凋亡的影响利用细胞共培养模型模拟病毒早期感染,检测病毒感染后Hela细胞Cas3/9的活性和活性蛋白的变化。(2)HTLV-1感染后对宿主细胞细胞自噬的影响利用细胞共培养模型模拟病毒早期感染,检测LC3B的表达;将LC3B-EGFP载体转染Hela细胞,转染结束后进行细胞共培养,共聚焦显微镜检测自噬体数目。(3)干扰EGR1对HTLV-1复制动力学的影响将EGR1 si RNA转染Hela细胞,转染24h后,加入等数量的MT2细胞共培养,western blot检测病毒感染后Hela细胞Cas3/9的活性、Cas3/cas9、LC3B、p19蛋白的表达、以及病毒核酸拷贝。结果1.EGR1在Tax蛋白阳性细胞中的表达(1)HTLV-1阳性T细胞中EGR1的表达检测发现HTLV-1阳性T细胞系中EGR1 m RNA和蛋白的表达至少比对照细胞系HTLV-1阴性T细胞系高出近3倍,差异明显(P<0.01),表明HTLV-1感染可以导致宿主细胞EGR1表达升高。(2)Tax蛋白对T细胞中EGR1表达的影响检测发现Tax P细胞中EGR1m RNA和蛋白对照细胞系Tax N细胞高出近3倍,瞬时转染Tax质粒后,EGR1m RNA和蛋白的表达也随着增高,差异均明显(P<0.01),且随着质粒转染量的升高而升高,这些结果均表明癌蛋白Tax可以导致宿主细胞EGR1的表达升高。(3)HTLV-1感染对宿主细胞EGR1表达的影响随着共培养体系中加入的MT2细胞比例增大,癌蛋白Tax也随着增高,同时EGR1 m RNA和蛋白的表达也明显增高,结果提示病毒早期感染也可以导致宿主细胞EGR1表达升高。2.Tax蛋白阳性细胞中EGR1表达调控特性的分析(1)构建不同长度的EGR1报告基因及其突变体成功构建EGR1全长报告基因E1以及截短体E2、E3和NBS缺失的Del E和-413/T-G点突变的Mut E。(2)报告基因活性分析将EGR1报告基因与p65 sh RNA转染Tax P细胞和MT2细胞后,检测发现E1、E2的荧光素酶活性明显高于E3、Del E和Mut E,而与p65 sh RNA共转染后明显低于对照载体组E1和E2的荧光素酶活性。提示调控EGR1表达的区域主要位于-422~-401bp的NFκB结合位点。(3)染色体共沉淀检测p65直接结合EGR1的调控序列染色体共沉淀检测发现p65可以直接结合EGR1的调控序列,区间位于-505bp~-223bp。3.p65介导的EGR1表达分析(1)NFκB抑制剂BAY 11-7082对EGR1表达的影响应用p65 sh RNA沉默p65后,MT2细胞和Tax P细胞中EGR1的表达下降将近一倍,同样地应用NFκB抑制剂BAY 11-7082后,EGR1的表达下调近60%。(2)不同Tax突变体对宿主细胞EGR1表达的影响发现转染野生型Tax和突变体M47组,EGR1的蛋白表达和E1、E2荧光素酶报告基因活性明显高于M22组(P<0.05),而E3、Del E、Mut E活性差异不明显(P>0.05),说明了不能激活NFκB途径的突变体M22促进EGR1表达的能力明显受损。4.EGR1对HTLV-1感染细胞中RELA表达的影响及机制的探讨发现EGR1可以促进Tax P细胞和MT2细胞p65蛋白的表达和NFκB的活性,且随着剂量增加而增加,EGR1还可以促进p65蛋白入核和促进NFκB结合DNA的能力,提示Tax蛋白阳性细胞中EGR1和NFκB存在着正反馈调节。5.EGR1促进HTLV-1感染细胞中NFκB活性的机制探讨在Tax存在条件下EGR1蛋白的半衰期延长;免疫共沉淀技术检测发现Tax蛋白和EGR1蛋白存在着直接作用,这提示HTLV-1可能是通过Tax蛋白延长EGR1蛋白的半衰期造成蛋白蓄积,导致宿主细胞中EGR1和NFκB的正反馈性持续活化。6.HTLV-1在Hela细胞中的复制动力学分析细胞共培养模型检测发现4h可以检测到HTLV-1核心蛋白p19的表达,但是8h时表达下降,随后逐渐升高;real-time PCR检测显示病毒核酸拷贝随着时间增加而逐渐增加。7.EGR1调控HTLV-1感染的机制分析(1)HTLV-1感染后对宿主细胞细胞凋亡的影响HTLV-1感染hela细胞后,cas3/7、cas9的活性和活化的cas3/9均无差异,提示病毒感染后不能诱导细胞凋亡。(2)HTLV-1感染后对宿主细胞细胞自噬的影响HTLV-1感染Hela细胞后,LC3B的表达和自噬体数目明显高于未感染组(0h),且随着时间增加LC3B表达逐渐增强(P<0.05),提示HTLV-1感染可诱导宿主细胞自噬。(3)干扰EGR1对HTLV-1复制动力学的影响宿主细胞中,用si RNA沉默EGR1后,检测显示Cas3/9活性和活性Cas3/9蛋白的表达没有差异,而自噬蛋白LC3B、HTLV-1核心蛋白p19的表达都明显降低,免疫荧光也发现自噬体数目减少,提示EGR1通过调节细胞自噬参与HTLV-1在宿主细胞中的复制动力学。结论1.HTLV-1感染宿主细胞中EGR1的高表达调控受NFκB调控。2.EGR1和NFκB之间存在着正反馈调节机制,癌蛋白Tax可以通过直接结合EGR1延长EGR1蛋白的半衰期,可能是EGR1和NFκB之间正反馈环的关键因素。3.HTLV-1感染可诱导宿主细胞自噬,EGR1可通过调节HTLV-1感染细胞的细胞自噬而影响病毒的复制。