木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的热带薯类作物,起源于亚马逊雨林与稀树草原交错地带,广泛种植于非洲、中南美洲及东南亚热带/亚热带地区。木薯具有高光效、高淀粉累积、耐贫瘠等特点,其储藏根富含淀粉,是这些地区许多国家的主要粮食作物。同时,木薯也是工业淀粉、燃料乙醇和绿色化工材料重要的原材料来源。光合产物以蔗糖的形式通过维管系统输送至地下储藏根,其淀粉合成代谢通路与其他物种大同小异。蔗糖合酶（Sus）是分解蔗糖生成UDPG或ADPG用于淀粉合成的第一个关键酶,蔗糖合酶活性是体现库强的重要生化指标。然而,木薯蔗糖合酶基因的转录调控机制,及相应的信号转导机制尚不清楚。因此,蔗糖合酶基因转录调控机制是理解木薯环境适应与淀粉高效累积的重要环节,对木薯的遗传改良具有重要意义。本研究围绕蔗糖合酶基因家族及其转录调控机制开展了系统的工作,主要研究结果如下:1、木薯蔗糖合酶基因家族由7个成员组成木薯Sus基因家族7个成员（MeSus1-7）可分为3个亚族。基因结构分析发现,MeSus1和MeSus4的5’UTR中都含有约1 kb的Leader intron结构。亚族内基因之间,外显子序列保守而内含子多样化。系统进化关系分析表明,木薯Sus归于双子叶分支,与同属大戟科的蓖麻和橡胶树亲缘关系最近。2、克隆了 MeSus1-7的全长序列并解析其保守结构域采用RACE-PCR技术克隆MeSus1-7的UTR区序列,并拼接成从转录起始位点至polyA的全长转录本,与此同时,5’RACE证实了MeSus 和MeSus1和的Leader intron的存在。木薯Sus家族成员中,至少包含一个Sucrosesynth和Glycostransf1结构域,MeSus6的C端含有跨膜基序。3、MeSus1和MeSus4是木薯Sus基因家族行使功能的主要成员在木薯不同组织中,MeSus1和MeSus4的表达量远高于其他成员,并且它们的转录水平也受不同激素和非生物胁迫处理的影响,存在一定的功能冗余与互补。4、构建了用于Y1H/Y2H文库筛选的可重复使用的储藏根全长cDNA文库提取了高质量的不同发育时期木薯储藏根总RNA,并分离纯化其mRNA。基于SMART技术原理合成ds-cDNA,结合改进后的pGADT7-Rec3,先在酵母细胞中构建了全长cDNA文库,其容量为4±1.7×106cfu。从酵母文库中分离质粒后,转化大肠杆菌超级感受态细胞,获得初级文库容量为1.4±0.3×107cfu的cDNA文库,保存管的滴度大于1010cfu/ml。经PCR检测,约70%克隆的插入片段大于 750 bp。5、筛选并鉴定了 6个调控MeSus1的转录因子基因克隆了MeSus1pro并构建用于Y1H文库筛选的Bait载体,pMeSus1pro-AbA。转化线性化的Bait载体,制备Bait酵母菌株,并测试其AbA背景浓度。利用全长cDNA文库,进行Y1H文库筛选,挑取729个酵母克隆进行PCR鉴定,对约400个样进行了测序。经功能注释,获得约24个转录因子基因,基于表达模式,选取其中6个为候选转录因子基因,分别是:bHLH1、ERF72、GRF2、GT1、TALE1、WRKY2。与MeSuss1的表达模式类似,6个候选转录因子在幼叶和成熟叶中的表达量显著地低于其它组织,其转录受不同激素和非生物胁迫的影响。6、候选转录因子与MeSus1pro存在相互作用6个候选转录因子拥有8个DNA结合结构域（DBD）。以木薯组培苗样品的第一链cDNA为模板,PCR克隆了 6个候选转录因子及其DBD,构建AD-TF和AD-TFDBD载体并转化Bait菌株。Y1H Assay结果表明,6个候选转录因子及其DBD均与MeSuslpro存在相互作用。采用冷诱导表达系统表达候选转录因子,发现6个转录因子在大肠杆菌中不表达或以包涵体形式表达。进一步单独表达其DBD融合蛋白时,发现5个候选转录因子的6个DBD能够表达出活性蛋白。DPI-ELISA分析确认5个候选转录因子能够在体外结合MeSuslpro。7、6个候选转录因子都定位于细胞核采用新设计的亚细胞定位载体,pSL1plus,构建CaMV35Spro::TF-GFP载体并制备农杆菌工程菌。通过在洋葱表皮细胞中瞬时表达融合基因TF-GFP,证实 bHLH1、ERF72、GRF2、GT1、TALE1、WRKY2 都定位于细胞核。8、4个转录因子拥有转录激活能力构建了 6个转录因子的BD-TF载体,并转化酵母菌株Y2HGold。通过逐一考查4个报告基因的表型,证实4个转录因子拥有转录激活能力,ERF72的转录激活能力最强,bHLH1次之,GT1较弱,GRF2最弱,TALE1和WRKY2几乎不能激活下游报告基因。9、4个转录因子以二聚体形式存在同时转化AD-TF和BD-TF至酵母菌株Y2HGold,通过Y2H试验分析表明,bHLH1、ERF72、GT1和TALE1存在寡聚化的现象,GRF2和WRKY2可能以单体形式存在。10、分别证实了 6个转录因子与MeSus1之间的转录调控关系基于双荧光素酶试验原理设计了用于Plant one-hybrid试验的新载体,pLuc2。以仅含reporter模块的载体为对照,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达体系,分别分析候选转录因子与MeSuslpro的调控关系。通过对Luc/REN值的分析,证实bHLH1能正调控MeSus1的转录,其余5个候选转录因子均为负调控子。