短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是肠道微生物厌氧发酵的主要产物。SCFAs不仅是动物重要的能量来源，而且在很多生理过程中发挥调节作用，可能介导肠道微生物对机体免疫和代谢的调节作用，并在人类肥胖、糖尿病和炎性肠道疾病的治疗过程中发挥重要作用。鉴于SCFAs的重要功能，其研究一直备受关注，但其内在作用机理仍存在很大的争议。SCFAs受体GPR41(Gprotein-coupled receptor41)和GPR43(G protein-coupled receptor43)的鉴定，为阐明SCFAs的作用机理提供了基础。目前已经陆续在人、小鼠、大鼠、牛和羊等物种上检测到GPR41和GPR43的表达，而关于猪GPR41和GPR43还鲜有报道。猪基因组中是否含有GPR41和GPR43基因，其是否在猪的不同组织中表达，及其表达规律尚需试验验证。近年的研究还发现，SCFAs可影响3T3-L1小鼠前脂肪细胞的分化，并且可能是通过SCFAs受体介导。猪具有很强的脂肪沉积能力，是研究脂肪代谢的良好模型。而SCFAs能否影响猪脂肪源间充质干细胞的分化，GPR41和GPR43是否介导SCFAs的调节功能，均是待解答的问题。本论文就上述一系列问题展开。　　1、猪GPR41和GPR43的鉴定及其表达规律　　近年研究发现，SCFAs是GPR41和GPR43的内源性配体，可激活GPR41和GPR43，从而发挥生物学功能。但是目前关于GPR41和GPR43的研究主要集中于人和啮齿动物，有关猪GPR41和GPR43的研究较少。因此，本试验的主要目的即研究猪基因组中是否含有GPR41和GPR43基因，并通过RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测GPR41和GPR43是否在猪的多种组织中表达，及其在不同组织和不同发育阶段的表达规律。结果发现，通过GenBank已知的GPR41和GPR43序列，利用BLAST程序与猪基因组比对后发现，猪的第6号染色体上含有GPR41和GPR43基因，并且与人、小鼠、大鼠和牛的GPR41和GPR43基因序列有很高的相似性。RT-PCR和Western blot技术检测发现，GPR41和GPR43在猪的肝脏、脾脏、回肠、结肠、肾脏、心脏、脂肪和肌肉组织中均有表达;免疫组织化学结果也表明，在脾脏、回肠、结肠和脂肪组织中均有GPR41和GPR43免疫阳性的细胞存在。Real-time PCR结果表明，GPR41和GPR43的表达具有明显的组织特异性和时间关联性;GPR41在回肠组织中的表达量最高，而GPR43则在脾脏中的表达量最高。综上所述，猪基因组中含有GPR41和GPR43基因，并在猪的多种组织中表达，其表达具有明显的组织和时间特异性。　　2、猪GPR41和GPR43 mRNA序列的扩增及SCFAs对GPR41和GPR43的激活　　目前GenBank数据库中尚没有猪GPR41扣GPR43的mRNA序列，及其所编码的氨基酸序列，因此本部分的主要目的即通过cDNA末端快速扩增(rapid amplificationof eDNA ends，RACE)获得猪GPR41和GPR43基因的mRNA序列，并预测其编码的氨基酸序列;同时应用萤光素酶实验(Luciferase assay)研究SCFAs能否激活猪GPR41和GPR43。通过RACE技术扩增得到了猪GPR41和GPR43的mRNA序列，其序列长度分别为2218bp和1908bp，并分别编码了含有335个氨基酸和329个氨基酸的蛋白质。软件分析发现，猪GPR41和GPR43蛋白均含有7个跨膜螺旋。萤光素酶实验结果表明，在共转染pCRE-Luc质粒和猪GPR41或GPR43表达质粒的中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary cells）中，SCFAs处理可抑制cAMP的水平，表明SCFAs可以激活GPR41和GPR43，通过Gαi途径抑制细胞内腺苷酸环化酶的活性，从而减少cAMP的生成。综上所述，本试验扩增获得了猪GPR41和GPR43的mRNA序列，并预测了其编码的氨基酸序列;同时还发现SCFAs可以激活GPR41和GPR43，进而发挥生物学功能。　　3、猪脂肪源间充质干细胞的分离培养和诱导成脂分化　　猪脂肪源间充质干细胞（porcine stromal vascular fractions，pSVFs）是从脂肪组织中分离得到的一种成体干细胞，具有很强的分化潜能，可被诱导分化为多种细胞。本试验利用Ⅰ型胶原酶消化猪的皮下脂肪组织，通过离心过滤后获得pSVFs细胞。待细胞生长至80％～90％汇合后，将细胞消化下来，接种至六孔板，生长至70％～80％汇合后，加入含有胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和罗格列酮培养基进行成脂分化，并于诱导分化后的第0、2、6、10和14天拍摄细胞照片，第10天收集细胞用于RNA提取和脂肪细胞分化标志基因的检测，第14天利用油红O对细胞进行染色。结果发现，本试验中分离的pSVFs细胞可被诱导分化为成熟的脂肪细胞，在分化后的第6天可见明显的脂滴累积;第10和14天时，脂滴累积逐渐增多，第14天的油红O染色亦可见脂肪细胞内有明显的脂滴。在此分化过程中，脂肪分化的标志基因PPARγ，C/EBPα，FABP4和leptin基因的表达水平显著升高，并分别于诱导后的第3、1、7和7天达到最高。由此可见，我们提取的pSVFs细胞具有分化为成熟脂肪细胞的潜能，可以用于后续的试验研究。　　4、SCFAs刺激猪脂肪细胞分化的机理　　SCFAs在很多生理过程中发挥调节作用，并被认为介导肠道微生物对人类肥胖、糖尿病和其他疾病的调节作用。但是，SCFAs内在的调节机理尚不明确。本试验以pSVFs细胞为模型，研究了SCFAs对猪脂肪细胞分化的影响及其内在作用机理。结果发现，SCFAs可刺激pSVFs的分化，增加成熟脂肪细胞的数目，上调PPARγ、C/EBPα、FABP4和leptin等脂肪细胞分化标志基因的表达;并且丙酸和丁酸的刺激作用要强于乙酸。丙酸可在短时间内刺激pSVFs细胞内C/EBPα的表达;丁酸可同时刺激pSVFs细胞内PPARγ和C/EBPα的表达;乙酸则没有此效应。PPARγ和C/EBPα是脂肪细胞分化的主要调节基因，而丙酸和丁酸可以启动这两个基因的表达，表明丙酸和丁酸刺激脂肪细胞分化有可能是通过上调PPARγ或C/EBPα的表达实现的。SCFAs的生理调节作用可能通过四条信号转导途径实现:1）激活GPR41和GPR43受体;2）激活cAMP-PKA通路;3）抑制AMPK活性;4）抑制HDACs活性。本研究未能在pSVFs分化过程中检测到GPR41和GPR43的表达，表明GPR41和GPR43可能没有直接介导SCFAs对pSVFs分化的刺激作用。Rp-cAMPS作为cAMP的阻断剂，并未阻断丙酸和丁酸引起的PPARγ和C/EBPα基因表达的变化，表明cAMP途径可能没有介导SCFAs刺激的脂肪细胞分化。AICAR是AMPK的激活剂，可以上调pSVFs内PPARγ和C/EBPα的表达;但AICAR的添加，并没有阻断丙酸和丁酸处理引起的PPARγ和C/EBPα表达的升高，反而刺激了丁酸引起的C/EBPα的表达，可见SCFAs刺激猪脂肪细胞分化可能也不是通过抑制细胞内AMPK的活性实现的。TSA是HDA Cs的特异性抑制剂，本研究中丙酸和丁酸与之相似，均可刺激脂肪细胞的分化，上调脂肪分化标志基因的表达;ChIP研究表明TSA、丙酸和丁酸均能增加pSVFs细胞内PPARγ和C/EBPα基因启动子上的乙酰化组蛋白H3的水平。综上所述，SCFAs可刺激猪脂肪细胞的分化，上调脂肪分化标志基因的表达，并且这种刺激作用可能是通过抑制HDACs的活性，从而刺激PPARγ或C/EBPα基因的表达实现的，GPR41和GPR43、cAMP和AMPK在SCFAs刺激的脂肪细胞分化过程中可能并不发挥作用。