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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于套式病毒目,动脉炎病毒科,动脉炎病毒属的有囊膜单股正链RNA病毒,基因组全长15kb左右,具有nsp1-nsp12 14个非结构蛋白和9个结构蛋白,能造成母猪怀孕后期流产,产死胎、弱胎、木乃伊胎等,引起仔猪、育肥猪呼吸道症状,死亡率升高。该病毒强烈抑制干扰素的产生,但外源IFNs对该病毒的复制具有强烈的抑制作用。Viperin属于干扰素刺激基因,对多种病毒均具有抗病毒作用。本实验扩增并克隆了猪和猴的Viperin基因,制备了该蛋白的多克隆抗体,首次证明了猴的Viperin蛋白具有抑制PRSV复制的作用,并揭示了其抗病毒机理。构建了猪的Viperin蛋白腺病毒表达载体,并在Marc-145细胞和PAMSs细胞上验证了猪Viperin蛋白对PRRSV的抗病毒作用,具体实验如下:1.猪、猴Viperin基因的克隆及在大肠杆菌中的表达与抗体制备Viperin基因作为干扰素下游基因(ISG),本实验为研究其抗病毒活性,从Marc-145和PK-15细胞提取并克隆了该基因。将Marc-145细胞和PK细胞铺24板,用IFN-α刺激24h后收集细胞,提取RNA,分别采用RT-PCR方法扩增猴和猪的Viperin基因,并克隆进入pEASY-blunt simple平末端连接测序载体,酶切鉴定后送公司测序。采用DNAstar分析猪和猴Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21, SDS-PAGE分析证明Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式完全佐剂进行乳化后颈背部皮下注射BALB/c小鼠,两周后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western-blot、IFA实验确定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以分别与腺病毒表达和真核表达载体pCI-sVIP等表达的Viperin蛋白进行特异性反应,为下一步研究猪和猴Viperin蛋白抗病毒性质奠定了基础。2.猴Viperin抑制PRRSV复制及其分子机制宿主抵抗病毒感染的第一道防线是先天性免疫反应。先天性免疫反应以干扰素的产生为特征,干扰素可刺激诱导产生一系列抗病毒蛋白。Viperin是干扰素诱导的内质网相关蛋白,对多种病毒的复制有抑制作用,但抗病毒机制仍然不明确。本文研究了mViperin蛋白在Marc-145细胞内对PRRSV复制的作用,结果表明,IFN-α接种Marc-145细胞后可诱导mViperin基因的上调,并可以以剂量依赖和时间依赖的方式抑制PRRSV复制。PRRSV感染细胞后,IFN-α基因的上调受到明显抑制,PRRSV通过干扰素非依赖途径诱导mViperin基因的表达。用过表达mViperin蛋白可通过剂量依赖的方式抑制PRRSV在Marc-145细胞内的复制,采用干扰siRNA方法缺失细胞内Viperin蛋白基因,PRRSV复制水平有所增加。此外,本研究发现mViperin蛋白抑制了 PRRSV的入胞,阻碍了 PRRSV基因的复制、转录和翻译,但其对病毒的装配和出壳没有作用。利用激光共聚焦实验证明mViperin蛋白和PRRSV的GP5、N蛋白在细胞内存在共定位现象。进一步用CO-IP实验验证,mViperin蛋白和PRRSV N蛋白在细胞内可相互作用,并发现mViperin蛋白N端第12-16位氨基酸对mViperin的抗病毒活性有重要的影响,mViperin α-helix区域影响该蛋白在细胞内的定位和形态分布。3.猪Viperin重组腺病毒的构建与鉴定Viperin作为干扰素刺激基因,在多种体细胞均有表达,且对多种种属的病毒具有抗病毒活性。为了深入研究猪的Viperin蛋白在Marc-145和PAMS细胞上的抗病毒活性,本研究通过PCR扩增猪Viperin基因,克隆进入穿梭载体pTrack-CMV-sViperin,经菌液PCR,酶切鉴定后送公司测序正确。利用Pme-I内切酶线性化穿梭载体,电转化大肠杆菌BJ5183后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒基因组DNA经内切酶Pac-I线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子rAd-Viperin。在显微镜下观察重组腺病毒rAd-Viperin感染细胞,可见GFP的表达。通过RT-PCR、Western-blot检测sViperin蛋白的表达,重组腺病毒可正确表达猪Viperin蛋白,且具有良好的猪Viperin反应原性,为下一步研究堵Viperin蛋白对PRRSV的抗病毒活性奠定基础。4.猪Viperin蛋白抑制PRRSV复制作用研究本研究构建了 pCI-sVIP表达载体,并利用pCI-sVIP研究了 sViperin蛋白在Marc-145细胞上对PRRSV复制的作用,结果表明,过表达sViperin蛋白可以抑制PRRSV在Marc-145细胞上的复制,且具有剂量依赖作用。实验证明sViperin蛋白抑制病毒的入胞,但其对病毒的装配和释放没有影响作用。另外,共聚焦实验证明sViperin蛋白主要定位于内质网等细胞器。sViperin蛋白和病毒的GP5、N蛋白在Marc-145细胞内存在共定位现象,进一步利用CO-IP实验证明,sViperin蛋白可以和N蛋白进行共沉淀,证明sVierin蛋白可以和N蛋白相互作用。进一步采用表达重组sViperin蛋白的腺病毒rAd-sVIP接种PAMSs细胞,结果证明过表达sViperin在PAMSs细胞以剂量依赖的方式抑制PRRSV的复制,且腺病毒表达的sViperin同样可抑制PRRSV的入胞。