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目的:1.人脐带来源的间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）对肝细胞氧化应激损伤的研究。2.MSC-CM治疗肝细胞氧化应激损伤过程中微小RNA（microRNA,miRNA）的差异性表达,探讨相关miRNA的调控机制。方法:1.人脐带来源的间充质干细胞（hUC-MSCs）的分离、培养、鉴定及MSC-CM的制备1.1从脐带中分离培养细胞;显微镜观察细胞形态;通过流式细胞学表型鉴定和诱导分化能力检测确定上述细胞具备间充质干细胞（MSCs）的特性。1.2MSCs融合至80%更换培养基,继续培养24 h后收集培养基,离心、过滤获取MSC-CM。2.MSC-CM修复肝细胞氧化应激损伤的研究人正常肝细胞株（L02）经1 mMH2O2作用3h,构建肝细胞氧化应激损伤模型;损伤模型经MSC-CM修复24 h制备肝细胞氧化应激损伤修复模型。使用凋亡、线粒体膜电位（MMP）、周期、细胞活性与凋亡相关蛋白等实验研究MSC-CM对肝细胞氧化应激损伤模型的影响。将L02细胞分为3组,即损伤组（H2O2）、损伤修复（H2O2+MSC-CM）与正常对照组（Control）。2.1凋亡与MMP检测:采用AnnexinV/PI双染、JC-1单染和流式细胞术检测MSC-CM对L02细胞凋亡和MMP的影响。2.2细胞周期:使用PI染色和流式细胞术检测MSC-CM对L02细胞周期的影响。2.3细胞活性检测:采用CCK8法检测实验组L02细胞的吸光度值并绘制增值曲线,研究MSC-CM对L02细胞活性的影响。2.4Western blot方法检测L02细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和BMF的表达。2.5凋亡形态学检测:Hoechst染色方法检测L02细胞在损伤与修复过程中细胞核的变化。3.筛选差异性表达miRNA及miRNA功能学验证3.1根据MSCs对肝硬化损伤模型拯救机制所行的miRNA微阵列基因芯片杂交分析结果筛选了在肝硬化损伤与修复过程中显著差异性表达的21种miRNA,RT-qPCR验证在L02细胞氧化应激损伤与修复过程中miRNA的差异性表达并筛选出差异性表达显著的4种miRNA（miR143,miR145,miR301a和let7a）。3.2应用生物信息学在线分析软件预测受miRNA调控的靶基因,根据文献确定和凋亡、周期、增殖及细胞代谢相关的靶基因,使用western blot方法验证在肝细胞氧化应激损伤与修复过程中靶基因的表达。3.3miR143功能学验证的研究:微阵列与RT-qPCR显示miR143的差异性表达最为显著。转染miR143的模拟物与抑制物,上调或下调L02细胞内miR143的表达,同时设置转染miRNA的阴性对照组（NC与inhibitor NC）与未经转染的L02细胞（Control）。转染miR143模拟物即miR143在L02细胞内过表达（mimics）;转染miR143抑制物即下调miR143的表达（inhibitors）。3.3.1RT-qPCR根据miR143差异性表达验证miR143是否成功转染入L02细胞。转染60 h后行凋亡、细胞活性、MMP、周期及其靶蛋白等检测,研究miR143的功能。采用流式细胞术研究miR143对L02细胞凋亡、MMP与周期的影响;CCK8方法检测miR143对肝细胞活性的影响;western blot方法检测miR143对靶蛋白HK2和ADRB1的影响。3.3.2肝细胞氧化应激损伤与修复过程中miR143功能学验证的研究:转染miR143的L02细胞在miR143转染60 h,经0.8 mM H2O2损伤2 h制备肝细胞损伤模型,结束损伤后L02细胞自我修复4-6h行凋亡,周期,细胞活性,预测靶蛋白与凋亡相关蛋白等检测。结果:1.hUC-MSCs的分离、培养与鉴定及MSC-CM的制备:成功分离培养出大量贴壁、集落样生长的长梭形或纺锤样的纤维细胞;细胞表面标志物CD44,CD73,CD90与CD105阳性表达,而CD31,CD34与CD45阴性表达;诱导分化鉴定示上述成纤维细胞可向成骨,成软骨和成脂肪细胞方向定向分化。上述细胞具有MSCs的生物学特性,收集MSC-CM。2.MSC-CM修复肝细胞氧化应激损伤的研究2.1凋亡与MMP检测:H2O2增加细胞凋亡率与MMP去极化比率,MSC-CM会降低上述变化。2.2细胞周期:H2O2会降低肝细胞G0/G1期比例,升高S+G2/M期比例;MSC-CM可逆转上述变化。2.3细胞活性检测:氧化应急损伤降低细胞活性,加入MSC-CM其明显上升。2.4Westernblot检测:H2O2组Bcl-2/Bax比值降低,加入MSC-CM其明显上升。2.5凋亡形态学检测:H2O2组细胞核为致密浓染或多相碎块状致密浓染,有时可见新月体;Control组与MSC-CM修复组无明显差别。3.差异性表达miRNA的筛选与功能学验证的研究3.1RT-qPCR 筛选出 miR143,miR145,miR301a 与 let7a。H2O2 损伤后上述 miRNA表达升高,MSC-CM救治后表达降低。3.2生物信息学软件预测靶基因,miR143调控的靶基因为HK2和ADRB1;miRNA145、miRNA301a与let7a调控的靶基因分别为DAB2,NR2C2和ESR2。Western blot分析示靶蛋白的表达均在H2O2损伤后降低,MSC-CM作用后升高。3.3 miR143功能学验证的研究3.3.1 RT-qPCR示mimics组miR143的表达显著上调,inhibitor组其表达明显下调。miR143成功转染入L02细胞且差异性表达。与inhibitor组相比,miR143的过表达（mimics）明显促进细胞凋亡、MMP的去极化,降低细胞活性;miR143的过表达可引起细胞周期阻滞。除此,mimics组中靶蛋白HK2和ADRB1的表达低于 inhibitor 组。3.3.2肝细胞氧化应激损伤过程中miR143功能学验证的研究:miR143的过表达显著增加损伤L02细胞的凋亡比例,降低细胞活性,细胞周期阻滞更加显著,靶蛋白HK2、ADRB1与Bcl-2/Bax的表达下降;miR143的低表达可降低损伤L02细胞的凋亡比率,增加细胞活性,解除周期阻滞,靶蛋白与Bcl-2/Bax表达上调;损伤条件下,miR143对凋亡,周期及靶蛋白的影响更加显著。结论:1.成功分离培养出hUC-MSCs,获取MSC-CM。2.MSC-CM通过调节凋亡、影响周期与细胞活性逆转并修复肝细胞氧化应激损伤。3.在肝细胞氧化应激损伤与修复中,miRNA发挥重要作用。MiR143通过调节凋亡、周期、细胞活性及靶蛋白HK2、ADRB1的表达等影响肝细胞氧化应激损伤的修复。MiR145、miRNA301a与let7a分别通过调控的靶蛋白DAB2、NR2C2和ESR2的表达参与肝细胞氧化应激损伤与修复进程。