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研究背景:肝癌是常见的恶性肿瘤之一,在目前已知所有癌症中,死亡率排在第三位。原发性肝癌主要包括两种病理类型:肝细胞肝癌和胆管细胞型肝癌。肝癌不仅给患者带来病痛及心理的负担,同时也给患者家庭和社会带来严重的经济压力,因此肝癌已经成为目前医学研究的热点。Kuro-o等发现Klotho基因缺陷小鼠可出现多种衰老症状,而Klotho的超表达则可延长小鼠的寿命。Klotho基因位于人的染色体13q12区域,大小为50kb。它编码单次跨膜蛋白,其由胞外结构域、单个跨膜结构域和胞内结构域组成。细胞内结构域非常短并且没有明确的功能。膜型Klotho蛋白作为成纤维细胞生长因子23(FGF23)的专属受体可调节磷酸盐稳态;细胞外结构域(分泌型Klotho)可被释放到循环系统中,起到循环激素的作用,调节氧化应激及多种生长因子受体和离子通道。Klotho在乳腺癌进展中的抗肿瘤作用在2008年首次被认定,最近数年,已经有很多文献研究探寻Klotho基因的表达与癌症进展之间的关系,然而该基因在癌症中的作用机制尚未明确。研究表明Klotho的表达在几种实体瘤中广泛下调,包括子宫颈癌,胰腺癌,黑素瘤和消化道肿瘤,其也参与血液系统恶性肿瘤的发病机制。在这些恶性肿瘤中,Klotho被阐明是几种信号通路的调节剂,包括FGF信号传导,胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和Wnt途径,Lu等对189个卵巢上皮癌患者进行了临床随访,结果显示分泌型Klotho基因的高表达与癌症的进展、癌症患者的死亡及IGF-I和IGFBP-3的表达呈负相关。在Wang等的报道中提到,作为一种新的抑癌基因,Klotho在胃癌中通过甲基化逐渐被灭活,对甲基化的Klotho蛋白的检测可以用来预测胃癌患者的预后。在结肠癌患者中,Klotho基因的下调与癌症的侵袭性及Dukes分期有关,而Klotho基因的超表达则可通过IGF1R介导的PI3K/AKT信号途径来抑制结肠癌细胞的增殖及侵袭。另外,Klotho可以抑制宫颈癌细胞的转移及侵袭能力,在宫颈癌的体外模型中Klotho的表达通过上调E-钙粘蛋白和下调N-钙粘蛋白及减少MMP-7和MMP-9的表达来降低癌症细胞的游走及侵袭能力。Zhou等的研究表明,Klotho能有效抑制大B淋巴细胞瘤肿瘤细胞的生长,Klotho的超表达能显著抑制大B细胞淋巴瘤中肿瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡,他们还发现在大B细胞淋巴瘤肿瘤细胞中阿霉素与重组人Klotho蛋白联合使用能增强它们抗肿瘤的功效,研究表明,通过转染Klotho载体途径实现的Klotho的高表达可显著抑制大B细胞淋巴瘤的移植物模型的肿瘤细胞生长。研究表明一些炎症因子可下调Klotho水平,同时Klotho也可反过来调节、抑制一些炎症因子(如TNF-α)的作用。在这方面,Wnt/β-catenin信号通路的异常活化在肝癌的发病机理中具有关键作用。据报道分泌型Klotho蛋白通过结合Wnt配体来阻止Wnt结合其同源细胞表面受体而达到抑制Wnt信号的作用。随着肝功能的衰竭,Klotho作为Wnt拮抗剂来诱导Klotho基因突变增强Wnt信号传导通路。然而,Klotho基因与原发性肝癌的发生发展的关系现在仍未阐明,探索肝癌的进展中Klotho基因的作用及可能的机制对肝癌的基础研究具有重要意义,我们期待明确其功能及其作用机制以便为肝癌患者的生物治疗提供治疗靶点。目的:1.通过运用MTT试验,逆转录PCR,克隆形成实验,流式细胞分析及免疫印迹分析法等方法检测分析Klotho超表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。2.探讨Klotho表达和Wnt/β-catenin信号转导通路之间关系。方法:1.通过MTT试验检测肝癌细胞的增殖。将肝癌细胞HepG2和SMMC-7721细胞接种在48孔板中,将细胞培养8个小时,将pCMV6-Klotho和pCMV-6载体转染载入细胞中继续培养24,48,72和96小时。最后,将MTT试剂加入培养液中,这种蓝紫色结晶就会溶解在DMSO中。将这种溶解液倒置在96孔板中,检测490nm和570nm之间波长的各孔的吸光值。2.应用逆转录PCR检测肝癌细胞中Klotho mRNA的含量,使用RNA提纯试剂盒用来提纯所有的RNA,逆转录酶Super-Script Ⅲ转录cDNA。原始序列式是:GAPDH,5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’和5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’和Klotho蛋白,5’-ACCTGG-TGGCGCACAACC-3’和5-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3’Klotho 的PCR反应是在94℃中进行5分钟,然后在94℃30秒,55℃30秒,72℃30秒共30个循环。最后,在72℃中进行10分钟。GAPDH的反应条件与Klotho相似,但退火温度为55 ℃30 秒。3.在肝癌细胞中转入pCMV6-Klotho载体,在稳定细胞系中转入pCMV-6细胞系。在克隆形成试验中,将细胞培养在6孔板中。在8小时后,将Klotho及对照组的载体转染载入对应的细胞中,培养14天。培养液每3天更换一次。用甲醇来固定这些集落。用1.25%的龙胆紫着色,然后在高倍镜下计数。4.流式检测分析用来测定肝癌细胞的凋亡,根据试剂盒说明书,利用V-FITC/PI膜连蛋白双染色。将转染pCMV6-Klotho和pCMV6载体的肝癌细胞在6孔板中培养48小时。将细胞用冰PBS培养液清洗3次,然后悬浮于HEPES-NaOH 10 mMpH 7.4,25mMCaCl2和144mMNaCl的混合培养液中。最后,在黑暗环境中冰上用AnnexinV和PI进行染色30分钟,然后将这些细胞进行流式细胞分析。5.通过免疫印迹分析法检测Klotho,β-catenin,C-myc和CyclinD1的表达,将肝癌细胞转移在48孔板中,培养8小时至它们粘连在一起。将细胞转入pCMV6-Klotho和pCMV-6载体48小时。转入pCMV6载体的细胞作为对组。实验组是转入rKlotho或者BSA(浓度为250ng/mL)的细胞。BSA作为负向的对照组。然后将细胞用冰水PBS冲洗,用细胞裂解液做电泳分析。结果:1.在肝癌细胞中发现Klotho低水平表达,用逆转录PCR和免疫印记分析法测定四种肝癌细胞中内源性Klotho水平并与永生型的L02肝细胞相比,检测到Bel-7404和HepG2,SMMC-7721等肝癌细胞中的mRNA和蛋白质含量更低。2.转染pCMV6-Klotho载体的HepG2和SMMC-7721 肝癌细胞培养24,48,72,96小时,在OD490nm可见转入p CMV6-Klotho的细胞数要比转入p CMV6载体的细胞数低,Klotho超表达明显的抑制了细胞的增殖能力。将重组Klotho转入SMMC-7721细胞和HepG2细胞中培养24,48,72,96小时后,可见重组Klotho可明显抑制肝癌细胞系HepG2的SMMC-7721增殖,更高含量的klotho具有更明显抑制肝癌细胞增殖的作用。Klotho的超表达及重组的Klotho均具有抑制肝癌细胞增殖的作用。3.克隆形成试验显示Klotho基因表达抑制肝癌细胞的增殖,将对照载体(pCMV6)和pCM V6-Klotho转入肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中,培养10天后可见转入pCMV Klotho的肝癌细胞克隆数要比转入对照组载体的数目明显减少。Klotho的表达抑制肝癌细胞的增殖,Klotho作为一个潜在的肿瘤抑制因子具有重要的肿瘤抑制作用。4.用流式细胞分析(PI和AnnexinV-FITC双染色)鉴定Klotho的超表达对肝癌细胞凋亡的影响。转染pCMV6-Klotho载体的HepG2细胞系的凋亡率比对照组明显增高(P<0.01),与做同样处理的SMMC-7721细胞系结果一致,表明Klotho蛋白可诱导肝癌细胞的凋亡。5.在肝癌细胞中Wnt/β-catenin的信号转导途径存在异常。在肝癌细胞HepG2中转染p CMV6-Klotho和对照组载体pCMV6,用免疫印迹分析法测定Klotho,β-catenin,C-myc和Cyclin D1的表达水平。在转染pCMV6-Klotho的肝癌细胞HepG2中Klotho的表达水平更高,而β-catenin,C-myc和CyclinDl的表达水平更低。这与肝癌细胞HepG2中转入Klotho并培养48小时后的结果一致。Klotho的高表达同时伴有β-catenin,C-myc和Cyclin D1的低表达。表明在HepG2细胞中Klotho的表达水平与Wnt/β-catenin的信号转导通路呈负相关。6.Klotho的超表达可降低内源性β-catenin的含量和抑制细胞核内的转录,β-catenin转录进入细胞核激活Wnt/β-catenin信号转导途径。在pCMV-Klotho转录的HepG2细胞中,β-catenin的含量与对照组相比在细胞质中明显增高。在pCMV6-Klotho转染的细胞中,β-catenin在细胞质及细胞核中均明显的降低,C-myc和Cyclin D1的表达水平也降低。所有数据表明,Klotho的超表达减少了β-catenin的内源性表达,也抑制了 β-catenin从细胞质经载体载入细胞核中。另外,与细胞进程有关的C-myc和Cyclin D1在Wnt/β-catenin下游的目的基因的转录也下调。结论:Klotho可抑制肝癌细胞的增殖,促进细胞凋亡。其作用机制可能由Wnt/β-catenin信号转导通路介导。Klotho可作为一个潜在的肝癌基因治疗靶点,可能为肝癌患者提供新的生物治疗手段。