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本研究以来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)中的热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因为研究对象,将其克隆至基因高效热激表达载体pHsh中,并实现了其在大肠杆菌中的表达,基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。为其应用于工业生产奠定了基础。
本研究利用在线的mRNA二级结构分析软件,通过基因定点突变,优化了mRNA的翻译起始区,使核糖体结合位点从发夹结构的互补配对区中释放出来,从而提高了表达量。通过对重组β-葡萄糖醛酸酶在TB培养基中诱导条件的研究,发现在OD600达到4左右时进行热激诱导,热激诱导8h,效果最佳。
纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80℃,最适反应pH值为5.0,pH值5.8~8.2之间酶的稳定性较好,80℃的半衰期为2h,SDS-PAGE分子量为65.9kDa,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol/L,Vmax值为312U/mg。
本研究首次将重组极耐热β-葡萄糖醛酸酶应用于甘草酸的催化。通过薄层层析和高效液相色谱法分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸,摩尔转化率为49%。
3L发酵罐发酵试验发现重组菌在TB培养基中发酵培养,最终OD600达到19.8,酶活达到8.54U/mL。重组菌在葡萄糖培养基中发酵培养,最终OD600达到33.1,酶活达到16.06U/mL。