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宫颈癌(cervical cancer)是最常见的女性生殖道恶性肿瘤,其死亡率在女性肿瘤中位居第二。高危型人类乳头瘤病毒(HPV)持续感染,是引起宫颈癌前病变和宫颈癌的基本原因,单纯HPV感染并不能直接导致宫颈癌发生,遗传学和免疫学等因素也发挥重要作用。微小RNA (miRNA)是一类小分子内源性非编码RNA,它与靶基因mRNA特异性结合,调控基因表达,在生命体生长、发育和细胞增殖、分化等生物学行为过程中起关键作用。miRNA亦可促进人类多种疾病的发生发展,尤其是肿瘤。已有研究表明,miR-31在不同肿瘤中存在异常表达且参与细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭和迁移等生物学过程。我们前期研究发现,miR-31在宫颈癌组织中高表达,但miR-31在宫颈癌患者血浆中的表达尚未见报道。本研究旨在检测宫颈癌血浆中miR-31的表达水平,分析miR-31与宫颈癌患者临床病理关系,探讨miR-31对宫颈癌细胞增殖、迁移能力的影响。第一部分 血浆中miR-31表达水平与宫颈癌临床病理的关系目的 探讨miR-31在宫颈癌患者血浆中表达水平及其与临床病理的关系。方法 收集2013年1月至2015年12月广西壮族自治区人民医院妇科收治的60例宫颈癌患者术前血浆及正常对照组血浆,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测宫颈癌患者血浆中miR-31表达水平,分析miR-31的表达水平与临床病理关系。结果miR-31在宫颈癌患者血浆中的相对表达量明显高于正常对照组,分别为2.96±0.67、1,差别具有统计学意义(P<0.05)。miR-31表达水平在淋巴结转移阳性组较阴性组高,分别为3.03±0.11、2.64±0.08,差别具有统计学意义(P<0.05)。miR-31表达水平在脉管浸润阳性组较阴性组高,分别为3.48±0.12、2.91±0.10,差别具有统计学意义(P<0.05)。miR-31表达水平在IIB2组、肿瘤直径>4cm组、年龄≥50岁组和中高分化组中增高,分别为2.87±0.11、3.04±0.15、3.03±0.16、3.02±0.11,无统计学差异(P>0.05)。结论宫颈癌患者血浆中miR-31呈高表达,且与宫颈癌患者淋巴转移、脉管浸润密切相关。第二部分miR-31慢病毒载体的构建及miR-31对宫颈癌细胞功能的影响目的构建miR-31慢病毒表达载体,检测miR-31对宫颈癌细胞生物学功能的影响。方法PCR扩增目的基因,将目的基因与pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体质粒经限制性内切酶XbaI、BamHI双切后连接,将重组表达载体质粒pCDH-miR-31送测序鉴定。用慢病毒质粒系统包括pCDH-miR-31、 pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G共转染293T细胞包装慢病毒,产生病毒液并测定滴度为3×107TU/ml。慢病毒感染Hela细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达miR-31的Hela细胞,Real-time RT-PCR检测Hela细胞中miR-31的表达水平。利用克隆形成实验、MTT法及Transwell-、室法检测miR-31对细胞增殖、迁移能力的影响。结果重组载体质粒pCDH-miR-31测序结果显示,测序峰图良好,插入片段与miR-31基因序列比对吻合度为99%。miR-31的表达水平在miR-31组较正常对照组明显增高,分别为3.78±0.28、1.29±0.17,有统计学差异(P<0.05)。克隆形成实验显示,miR-31组克隆形成率较正常对照组高,分别为41.16%±5.79%、28.60%±4.14%,有统计学差异(P<0.05)。MTT结果显示,miR-31对Hela细胞的增殖能力有促进作用,在第五天最明显,OD值分别为2.096±0.032,1.578±0.034,有统计学差异(P<0.05)。细胞迁移实验显示,miR-31组较正常对照组迁移能力强,穿透基底膜细胞数分别为194.6±14.39、130.2±18.01个,有统计学差异(P<0.05)。结论成功构建miR-31慢病毒表达载体及筛选过表达miR-31的Hela细胞,miR-31能促进宫颈癌Hela细胞增殖及迁移能力。