胃癌是我国第二大常见的肿瘤,高居肿瘤相关死亡率的第二位。即使采取积极的治疗,中晚期患者的5年生存率仍不足30%。肿瘤的进展及其对治疗的反应受免疫系统的影响,肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用决定了肿瘤的转归。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是免疫反应的启动者,双重调控抗肿瘤免疫反应及肿瘤免疫逃逸。肿瘤微环境中DCs介导的免疫反应类型取决于与肿瘤细胞相互作用后DCs的成熟状态。成熟DCs高表达共刺激分子及抗原呈递分子,刺激T细胞增殖和分化,促进抗肿瘤免疫反应,而未成熟DCs抗原呈递功能障碍,分泌免疫抑制性因子,并通过诱导T细胞无能和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)扩增,促进肿瘤免疫逃逸。目前认为肿瘤细胞通过下调抗原,或分泌免疫抑制性因子阻碍DCs的成熟,介导肿瘤免疫逃逸,促进肿瘤进展。非编码小RNA(small non-coding RNAs,snRNAs)是一类不编码蛋白质,直接以RNA形式在转录前或转录水平调控编码基因的RNA,目前对snRNAs的功能研究主要集中在微小RNA(micro RNAs,miRNAs)和piwi结合RNAs(piwi-interacting RNAs,piRNAs)上。SnRNAs高度稳定,保存10年的甲醛固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)组织与新鲜组织的miRNA表达谱无明显差异。体液中也可检出大量的snRNAs,它们源于多种组织细胞,并作为细胞间信息传递的介质,调节细胞间的物质交换。研究发现,胰腺癌细胞可以分泌富含mi R-212-3p的外泌体,将其与DCs共培养后,DCs中MHC-II表达下降,介导免疫耐受。这一结果提示,在肿瘤微环境中,肿瘤来源的miRNAs可被DCs摄取,参与肿瘤免疫的调节。胃癌的发生发展过程中,伴随着细胞内外snRNAs表达谱的变化。与健康受试者相比,胃癌患者外周血中单核细胞来源的DCs中MHC-II及HLA-DR表达明显减少,提示成熟受阻,而成熟DCs的组织浸润与患者术后的无病生存期及总生存期呈正相关。胃癌微环境中dcs的成熟状态是否与胃癌细胞来源的snrnas有关,目前尚无文献报道。此外,肿瘤分泌入血的snrnas还可用于肿瘤的无创诊断及病情监测。已有研究通过大样本的逐步验证证实了snrnas作为胃癌诊断标记物的可行性,但大部分只关注了胃癌患者外周血中snrnas的表达,忽视了其来源,因此这些标记物并不能完全反应肿瘤组织中胃癌细胞的代谢情况。本研究旨在通过对ffpe组织及血浆样本进行高通量测序,筛选出胃癌细胞分泌的snrnas,验证其作为胃癌诊断标志物的可行性。观察其是否能作为信号分子被dcs摄取,调节其功能,进而影响肿瘤免疫,为胃癌的诊断及治疗提供新的理论依据。具体实验分为以下三个部分:第一部分胃癌诊断标志物血浆非编码小rna的筛选目的:了解snrnas在组织及血浆样本中的表达特征,筛选出胃癌的标记物,并建立基于snrnas的胃癌诊断模型。方法:收集82例胃癌患者血浆样本,82例健康对照血浆样本;另收集8对胃癌患者肿瘤组织及其癌旁对照的ffpe样本。首先对2对混合的血浆样本和2对混合的组织样本分别进行深度测序,其中混合样本来自8对(i-iv期各2对)相应组织;然后在82对血浆样本中应用实时定量pcr(qrt-pcr)技术对候选snrnas进行验证,并应用kruskal-wallis检验和dunn-bonferroni检验分析snrnas表达量与临床分期的关系;最后,应用二分类logistic回归分析建立胃癌的诊断模型,并应用roc曲线检测snrnas对胃癌的诊断效能。结果:1非编码小rna高通量测序结果分析1.1原始测序数据的片段长度分布本研究对送检标本中长度为18-35nt的rna进行了测序,ffpe样本的小rna长度分布区间为20-36nt,有两个峰值,分别位于22nt和32nt附近,说明存在明显的mirnas及pirnas富集;血浆样本中的小rna长度分布区间为10-32nt,单个峰值出现在21nt附近,说明只有mirnas的明显富集。1.2原始测序数据的序列种类及数量胃癌及癌旁的ffpe标本中,与数据库比对上的已知mirnas分别有6473种和4236种,分别占所有注释小rna种类的0.92%和0.83%,占其数量的33.11%和24.19%,说明测序样品中的mirnas种类较少,但表达水平较高;在胃癌及健康体检人群的血浆标本中,上述特征更加明显,mirnas分别有2466种和2609种,分别占所有注释小rna种类的0.98%和0.92%,却占其数量的40.36%和54.79%。与mirna相比,与现有数据库比对上的pirnas的种类及数量极少。1.3非编码小rna的差异表达分析在ffpe及血浆样本中差异表达的snrnas分为以下4种,在胃癌的ffpe及血浆样本中均升高的snrnas(31个,均为mirnas),在两种样本中均下降的snrnas(1个,为mirna),在胃癌ffpe样本中升高而在血浆样本中下降的snrnas(4个,3个mirnas和1个pirna),在胃癌的ffpe样本中下降而在血浆样本中升高的snrnas(4个,均为mirnas)。2胃癌相关非编码小rna的验证及其对胃癌的诊断价值2.1胃癌相关非编码小rna的筛选与验证本研究重点关注在胃癌的ffpe及血浆样本中均升高的31个mirnas。本课题组前期研究应用qrt-pcr技术在23对胃癌ffpe标本及42对血浆标本中对这31个mirnas进行了逐一的验证,结果证实共有5个mirnas(mir-17-5p,mir-127-3p,mir-379-5p,mir-433-3p,mir-654-3p)的表达趋势与测序结果一致。为了验证其在人群中作为肿瘤标记物的可能性,本研究进一步扩大样本至82例,应用qrt-pcr技术检测胃癌患者及其健康对照的血浆样本中5种mirnas的表达水平。结果显示5种mirnas在胃癌患者血浆中的相对表达量均显著升高,提示其可能成为胃癌诊断的肿瘤标记物。2.25种mirnas与胃癌临床分期的关系mir-17-5p,mir-379-5p,mir-433-3p,mir-654-3p在各期胃癌血浆样本中的表达水平均较健康对照组显著升高,但这4种mirnas在胃癌各期之间的表达水平无显著性差别,提示其在胃癌早期即达到较高水平,这一高表达状态在胃癌进展过程中一直持续;mir-127-3p在i、ii、iii期胃癌患者血浆中的表达水平有显著性升高,在iv期胃癌患者血浆中的表达量下降,与健康对照间无统计学差异,提示mir-127-3p的分泌在iv期胃癌可能受到抑制。2.3单个mirna对胃癌的诊断价值绘制受试者工作曲线,mir-17-5p,mir-127-3p,mir-379-5p,mir-433-3p,mir-654-3p的曲线下面积分别为0.82(95%ci:0.75-0.88),0.78(95%ci:0.71-0.85),0.81(95%ci:0.74-0.88),0.78(95%ci:0.71-0.85),0.76(95%ci:0.69-0.83),提示这5个mirnas均具有较好的诊断胃癌的效能,其中以mirnas-17-5p的诊断效能最佳。2.4胃癌诊断模型的建立应用二分类logistic回归分析建立胃癌的诊断模型。mir-17-5p和mir-127-3p是胃癌患病的危险因素。胃癌的诊断公式为:y=110.98emir-17-5p+66.5emir-127-3p-2.73其中emir-17-5p是mir-17-5p在患者血浆中的表达量(2-Δct值),emir-127-3p是mir-127-3p在患者血浆中的表达量。以y=0.55为诊断点,诊断模型在区分胃癌患者和健康受试者的敏感度为67.10%,特异度可达96.30%,诊断的曲线下面积为0.84(95%ci:0.78-0.90),与单一指标相比,诊断效能有所提高。结论:1在胃癌ffpe样本及血浆样本中,mirnas种类少,表达量高。2血浆中的mir-17-5p,mir-127-3p,mir-379-5p,mir-433-3p,mir-654-3p可能源于胃癌细胞的直接分泌,并在胃癌早期明显升高。3血浆中mir-17-5p和mir-127-3p是胃癌患病的危险因素。胃癌的诊断公式为:y=110.98emir-17-5p+66.5emir-127-3p-2.73,y大于0.55时认为受试者存在胃癌。第二部分胃癌细胞来源的mir-17-5p抑制树突状细胞成熟目的:探究胃癌细胞来源的mir-17-5p对dcs成熟的影响。方法:应用qrt-pcr技术检测胃癌细胞培养基中mir-17-5p的表达水平,观察其分泌情况。用cy3标记hsa-mir-17-5pmimics,收集胃癌细胞的条件培养基与dcs共培养,用流式细胞术及共聚焦显微镜观察dcs对hsa-mir-17-5pmimics的摄取。分离小鼠脾脏dcs,经磁珠提纯,应用流式细胞术检测dcs的表型及fitc-葡聚糖吞噬率;qrt-pcr及elisa检测各组dcs中细胞因子的表达水平。dcs经丝裂霉素c处理后与cd4+t细胞共培养,应用brdu掺入实验检测cd4+t的增殖能力,流式细胞术检测共培养体系中treg(cd4+cd25+foxp3+)的比例。结果:1人胃癌细胞可分泌mirna-17-5p应用qrt-pcr技术检测人胃癌细胞系bgc-823细胞及培养基中该小rna的表达水平,结果显示,以低浓度种植的细胞,其培养基中mir-17-5p的相对表达量呈时间依赖性,以中浓度种植的细胞,其培养基中mir-17-5p的表达量时间依赖性不明显;以高浓度种植的细胞,mir-17-5p在换液24h后表达明显增多,而在换液48h后表达量较前下降。在换液24h后,培养基中mir-17-5p的表达量与细胞数呈正相关。以上数据提示胃癌细胞可以分泌mir-17-5p至细胞外,且在一定数量内呈时间依赖性分泌,细胞过密影响mir-17-5p的分泌。2人未成熟dcs可以摄取人胃癌细胞释放的mirnas-17-5p用cy3标记hsa-mir-17-5p转染胃癌细胞,收集其条件培养基与人未成熟dcs(immuturedendriticcell,imdcs)进行共培养,应用流式细胞术检测imdcs中cy3阳性细胞的百分比。结果显示,与不处理、只加入转染试剂和转染普通hsa-mir-17-5p的胃癌细胞条件培养基共培养的imdcs中只检测到微弱的cy3荧光信号,而与转染cy3标记hsa-mir-17-5p的胃癌细胞条件培养基共培养的imdcs中,cy3阳性细胞百分比显著升高。进一步应用共聚焦显微镜观察各组imdcs中的cy3信号,结果显示,只在与转染cy3标记hsa-mir-17-5p的胃癌细胞条件培养基共培养的imdcs中见到微弱的红色cy3信号,其余3组均未见cy3信号。提示人imdcs可以摄取人胃癌细胞分泌的mir-17-5p。3mir-17-5p抑制lps诱导的imdcs成熟3.1mir-17-5p抑制lps诱导的dcs成熟标志物表达对小鼠来源的dcs进行分离、鉴定及免疫磁珠分选,流式细胞术鉴定其纯度。cd11c+细胞的百分比可达95%以上。imdcs经lps刺激后,细胞表面dcs成熟标志cd80、cd86、mhc-ii的表达水平均显著升高。预先转染mmu-mir-17-5pmimics的imdcs在lps刺激后细胞表面cd80、cd86、mhc-ii的表达水平并没有明显变化,显著低于转染scramblecontrol的imdcs。提示mir-17-5p抑制lps诱导的小鼠dcs成熟标志物表达。3.2mir-17-5p可对抗lps依赖的抗原吞噬抑制imdcs在成熟过程中,吞噬功能逐渐下降,用fitc标记的葡聚糖内吞实验检验其吞噬功能。结果显示,imdcs经lps刺激后,吞噬功能显著下降,转染mmu-mir-17-5pmimics的imdcs在lps刺激后其抗原吞噬功能显著高于转染scramblecontrol的imdcs,但仍显著低于imdcs。提示mir-17-5p可对抗lps诱导的抗原吞噬抑制,但尚不能恢复到刺激前的水平。3.3mir-17-5p调节lps诱导的dcs细胞因子分泌谱应用qrt-pcr及elisa分别检测il-12、tnf-α、il-10在mrna及蛋白水平的表达情况。结果显示,imdcs产生低水平的il-12、tnf-α,和较高水平的il-10,lps刺激后,il-12、tnf-α表达水平显著升高,il-10表达水平显著降低;预先转染mmu-mir-17-5p的imdcs,在lps刺激后,与转染scramblecontrol的imdcs相比,tnf-α和il-12表达水平显著降低,il-10的表达水平显著升高。提示mir-17-5p促进免疫抑制因子的合成和释放,而抑制抗肿瘤免疫因子的合成和释放。4转染mir-17-5p的dcs对t细胞的调节作用4.1转染mir-17-5p的dcs抑制cd4+t细胞的增殖免疫磁珠提纯t细胞。流式细胞术结果显示,分选后,cd4+t细胞的百分比均达95%以上。dcs经丝裂霉素c处理后与同种异体的cd4+t细胞共培养,应用brdu掺入实验检测cd4+t的增值能力。结果显示,imdcs经lps刺激后,刺激cd4+t细胞增殖的能力显著性提高;而转染mmu-mir-17-5p的dcs(dcs-mir-17)经lps刺激后再与t细胞共培养时,与转染scramblecontrol的imdcs相比,刺激t细胞增殖的能力明显减弱。以低dcs比例(1:20,1:50,1:100)与t细胞共培养时,dcs-mir-17刺激t细胞增殖的能力与imdcs类似,而以高dcs比例(1:10)共培养时,dcs-mir-17刺激t细胞的能力较imdcs显著性降低。提示mir17-5p降低了dcs刺激cd4+t细胞增殖的能力。4.2转染mir-17-5p的dcs促进treg的扩增应用流式细胞术检测共培养体系中cd4+cd25+foxp3+treg的比例。结果显示,与mdcs相比,与imdcs共培养的t细胞中,treg比例明显增多,而dcs-mir-17诱导的treg显著多于转染scramblecontrol的imdcs诱导的treg,甚至高于未转染的imdcs。以上数据表明mir17-5p处理的dcs促进cd4+cd25+foxp3+treg的扩增。结论:1mir-17-5p由胃癌细胞分泌,被dcs摄取。2mir-17-5p抑制lps诱导的dcs成熟。3胃癌微环境中,mir-17-5p通过抑制dc成熟,抑制cd4+t细胞增殖,促进treg扩增。第三部分mir-17-5p靶基因的筛选及验证目的:筛选mir-17-5p对抗lps诱导的dcs成熟的靶蛋白,阐明其抑制肿瘤免疫的机制。方法:在mirtarbase数据库检索已验证的mir-17-5p靶基因,进行go富集分析及kegg通路分析,找到参与免疫系统发育的基因集,将基因集映射到string中构建基因编码的蛋白之间相互作用关系网,筛选结合分数大于0.7的相互作用关系对,导入cytoscape计算各个节点的拓扑特性,筛选核心基因。应用qrt-pcr验证mir-17-5p对靶基因的调控。用westernblot验证mir-17-5p靶基因的功能。结果:1mir-17-5p靶基因的富集分析在mirtarbase上检索已验证的靶基因进行整理。结果显示,已验证过的mir-17-5p靶基因共有1142个,其中经报告基因实验验证过的靶基因共63个,这些靶基因均是mir-17-5p的直接作用靶点。对63个靶基因进行go富集分析和通路富集分析。结果显示,这些基因在免疫学过程(immunesystemprocess,42.86%)和发育过程(developmentalprocess,63.49%)中存在显著的富集。kegg通路富集结果显示,这些基因主要在肿瘤通路(pathwaysincancer,28.57%)及mirnas相关的肿瘤通路(mirnasincancer,22.22%)中富集。2免疫系统发育过程相关的mir-17-5p靶基因筛选本研究重点关注同时参与了免疫学过程和发育过程的23个基因。将数据导入string进行分析,去除孤立及涣散链接的基因,结果显示,共有22个基因的编码蛋白存在相互间作用,形成相互作用网络图。挑选结合分数大于0.7的关系对,将其对应数据导入cytoscape计算网络节点的拓扑特性。结果显示,该网络由19个节点和70条边组成,最大度值(degree)为8,最小度值为1,平均3.68±2.31。本研究认为在网络中起主要作用的核心基因(hubgenes)为度数≥mean+1sd的蛋白所对应的基因,即pten,bcl2,cdkn1a,hif1a及vegfa。3胃癌免疫相关的mir-17-5p靶基因的进一步筛选kegg通路分析显示参与免疫系统发育过程的5个核心基因均参与了肿瘤通路,进一步在keggdisease在线数据库中进行检索,发现bcl2和vegfa与胃癌相关,提示这两个基因有可能通过调控免疫系统的功能影响胃癌的发生发展。4mir-17-5p抑制imdcs中bcl2的转录向imdcs转染mmu-mir-17-5pmimics,或scramblecontrol。应用qrt-pcr技术检测bcl2和vegfa的表达。结果显示,与转染scramblecontrol的imdcs相比,转染mir-17-5pmimics的imdcs中bcl2表达显著下降。vegfa的表达量在转染mir-17-5pmimics及转染scramblecontrol的imdcs间没有差异。结果提示,mir-17-5p抑制imdcs中bcl2的转录。5mir-17-5p促进imdcs的凋亡既往研究表明,imdcs吞噬凋亡细胞中的自身抗原,维持自身的未成熟状态,介导对自身抗原的免疫耐受。而吞噬了凋亡dcs的imdcs,对lps诱导的成熟不再敏感。本研究应用western技术检测dcs中凋亡相关蛋白的表达。结果显示,与转染scramblecontrol的dcs相比,预先转染mmu-mir-17-5pmimics的dcs中bcl-2蛋白表达显著下降,促凋亡蛋白bax以及cleavedcaspase-3的表达升高。提示mir-17-5p促进dcs的凋亡。上部分结果证明,mir-17-5pmimics增强了dcs的抗原吞噬功能,因此我们推断mir-17-5p转染后,存活dcs通过吞噬凋亡dcs,抑制lps诱导的成熟。结论:1pten,bcl2,cdkn1a,hif1a及vegfa是免疫系统发育过程中mir-17-5p调控网络的关键基因,其中bcl2和vegfa与胃癌相关。2mir-17-5p以bcl2为靶点,抑制其表达,促进imdcs凋亡,从而抑制lps诱导的imdcs成熟。