胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤,其患者的5年生存率不到5%。胰腺癌具有易复发转移、预后差、致死率高和耐药性高等特点。我们前期研究发现糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖Glypican-6(GPC6)在胰腺癌组织中高表达,但其作用机制仍不明了。胰腺癌发生发展机制尚不清楚,缺乏高效低副作用的药物干预是胰腺癌治疗面临的挑战。吉西他滨,作为治疗胰腺癌的一线药物,经常伴随着严重的副作用。因此,寻找低毒高效的抗胰腺癌候选药物和探究胰腺癌的发病机制是治疗胰腺癌的核心任务。本课题主要研究糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC6在胰腺癌中的功能及机制和天然药物多糖对胰腺癌的影响。前人研究表明GPC6是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,其糖链(HS链)是细胞生长因子共受体(Co-receptor)。HS链在肿瘤生长、侵袭和转移中发挥重要功能,因此理论上外源性给予糖链干预可能发挥抑制肿瘤细胞生长和侵袭的作用。果胶是存在于植物细胞壁中,在结构和功能上最复杂的多糖,由半乳糖醛酸聚糖主链和中性糖侧链组成。复杂的结构使其具有许多功能,果胶不仅可以作为功能性食品的成分,还可以应用于广泛的药物研究。在之前的研究中,已经发现了果胶的多种生物活性,例如抗肿瘤、增强免疫力、抗衰老、抗氧化和抗糖尿病等。此外,与化学疗法药物相比,果胶在抗胰腺癌方面具有较低的细胞毒性,显示出较好的优势。因此,进一步研究果胶在胰腺癌中的活性及其机制可能为抗胰腺癌研究提供新的思路,特别是对开发新的抗胰腺癌药物提供新的机会。远志(Polygala tenuifolia)是传统的安神益智中药,药用部位为根。含有多种化学成分,已报道的主要包含三萜皂苷类、糖类、酮类,也含有少量的生物碱、香豆素、木质素类等,具有多种药理学功效,有良好开发和应用前景。现代医学研究表明远志具有抗老年痴呆、抗抑郁、抗肿瘤、抗氧化以及改善记忆能力等功能。远志多糖是从远志的根中提取的有效成分之一。但是远志多糖在抗肿瘤领域鲜有报道。我们从远志分离纯化出果胶多糖RP02-1,对RP02-1进行抗胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌和肝癌五种肿瘤的活性筛选,发现RP02-1对胰腺癌细胞As PC-1和Bx PC-3的抑制率分别为41.83%和57.54%。此外,RP02-1对正常的肝细胞和胰腺导管上皮细胞的生长没有影响。克隆形成实验表明,RP02-1可以抑制Bx PC-3和As PC-1细胞形成的克隆的数目大小。细胞划痕与Transwell实验的结果显示,RP02-1还可以抑制胰腺癌细胞Bx PC-3和As PC-1的迁移。Hoechst 33258染色法、Annexin V/PI双染色法的结果显示,RP02-1能够诱导胰腺癌细胞Bx PC-3和As PC-1的凋亡。机理研究表明,凋亡相关功能分子Bcl-2在RP02-1处理后表达下调;而Bax和Cleaved Caspase-3在RP02-1处理后表达上调。此外,远志多糖RP02-1能够抑制Bx PC-3细胞的自噬。通过RT-q PCR和Western blot结果分析发现,自噬相关分子Beclin-1,Atg5和LC3B在RP02-1处理后表达显著下调。进一步证实了RP02-1的抗胰腺癌作用,我们进行了体内实验研究。通过胰腺癌细胞Bx PC-3皮下移植瘤实验,我们发现,RP02-1低浓度(5 mg/kg)和高浓度(50 mg/kg)处理组相对于对照组的抑制率分别为49.58%和55.45%。在整个实验过程中,RP02-1对小鼠的体重没有任何明显的影响,表明RP02-1几乎不具有显著毒副作用。显示出很好的安全性。综上所述,我们从远志中分离纯化出一种果胶RP02-1,并且发现RP02-1可能具有抗胰腺癌活性。本研究发现,RP02-1能够通过抑制细胞增殖、抑制细胞迁移、诱导细胞凋亡以及抑制细胞自噬来发挥抗胰腺癌作用。这些研究提示,RP02-1具有成为抗胰腺癌药物开发的先导化合物的潜力。上述研究表明RP02-1能够发挥抗胰腺癌活性。但是目前针对胰腺癌的发病机制研究,缺乏有效的药物作用靶点和生物标记物。因此,我们选取细胞膜表面的蛋白聚糖,研究其在胰腺癌发生发展中的作用机制。本课题组前期大量的研究表明,GPC6在胰腺癌中高表达,并且在细胞增殖、迁移、侵袭和EMT过程中都有重要的作用。本课题聚焦于GPC6促胰腺癌的信号通路和分子机制的研究。我们选取了PANC-1和SW1990细胞系,每种细胞都构建敲减和过表达GPC6和相应的对照稳转细胞系,并通过Western blot检测敲减或过表达GPC6的效率。通过免疫荧光实验,发现在SW1990细胞中敲低GPC6,FOXO3a的表达量上调。同时,在PANC-1细胞中转录因子FOXO3a参与敲减GPC6介导的抗胰腺癌活性中。进一步的机制研究发现,敲减GPC6后,可抑制Kras/MEK/ERK/FOXO3a信号通路,进而促进FOXO3a表达,进一步发挥其抗胰腺癌活性。上述研究表明,果胶多糖RP02-1可能是抗胰腺癌的先导化合物,GPC6可能是抗胰腺癌的药物新潜在靶点。上述研究为我们理解聚糖在胰腺癌发生发展中担任关键角色提供了新的证据,也为基于多糖创新药物研究奠定了良好基础。