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国外学者将奶牛由妊娠后期(产前2~3周)转变为泌乳初期(产后2~3周)这一阶段称之为过渡期(transition period),以往称为围产期(Periparturient period)。以肝脏脂肪蓄积和脂肪变性为病理特征的奶牛脂肪肝是围产期奶牛重要的群发性常见多发病,肝极低密度脂蛋白(VLDL)组装与分泌是围产期奶牛脂肪肝等能量代谢障碍性疾病的主要环节,低密度脂蛋白受体(LDLR)是肝脏VLDL组装与分泌的主要调节蛋白,参与并调节脂质代谢、决定脂类代谢途径、调节血浆脂蛋白水平。 本文通过围产期健康奶牛饲养试验、体外奶牛肝细胞原代培养实验和定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从细胞水平和分子水平,探讨了能量状态、神经内分泌因子和代谢产物对奶牛肝低密度脂蛋白受体基因表达的调控作用及机理,为防治奶牛脂肪肝等围产期能量代谢障碍性提供实验和理论依据。 奶牛饲养试验:选取30头5-8岁、3-5胎泌乳量7000Kg左右的妊娠荷斯坦奶牛,随机分为3组,预饲一周后,分别于产前28d开始饲喂按中国奶牛饲养标准(2000)配制的标准日粮(对照组)、标准日粮能量增加20%日粮和标准日粮能量减少20%日粮,产后各组均按中国奶牛饲养标准配制的产奶日粮饲喂。整个试验期间每日早、中、晚定时饲喂,至产后56d结束。在试验期产前28d、14d和产后1d、14d、28d及56d,分别采取肝脏组织,应用半定量RT-PCR法测定肝组织中LDLR基因的mRNA丰度。结果表明:干乳期低能显著上调奶牛围产期肝脏LDLR mRNA水平,干乳期正常和高能饲喂显著上调奶牛产后肝组织LDLR mRNA丰度,且显著低于低能组,但产后14d后各组奶牛肝LDLR mRNA水平均显著降低,说明一方面奶牛产后肝TG含量增加可能抑制了LDLR mRNA表达,另一方面产后LDLR mRNA水平提高可能阻碍了VLDL的组装与分泌,这也可能是低能组奶牛产后肝TG含量增加的原因,肝LDLR mRNA的表达水平可能是奶牛肝VLDL在泌乳初期组装和分泌的主要调节因素之一,但干乳期低能饲喂上调奶牛围产期肝LDLR mRNA丰度的原因还有待进一步探讨。 肝细胞体外原代培养实验:选取临床检查无异常的未哺乳新生牛,颈动脉放血致死,无菌条件下采取肝脏后叶组织,采用剪切消化法分离肝细胞,按每孔10~6个/mL接种多聚赖氨酸包被的6孔细胞培养板,于37℃,5%CO2培养箱中培养,每24h换液一次,倒置显微镜下观察细胞生长情况,待细胞完全贴壁可进行试验。本实验采用半定量RT-PCR方法,测定了细胞培养液中添加不同浓度的胰岛素(0 nmol/L、1nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L)、胰高血糖素(0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L)和瘦蛋白(0 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)对新生犊牛原代培养肝细胞LDLR mRNA表达水平的影响。结果表明:①随着细胞培养液中胰岛素浓度的增加,肝细胞中LDLR mRNA的表达水平随之升高。说明胰岛素促进LDLR mRNA表达;②胰高血糖素对肝细胞LDLR mRNA表达具有抑制作用,随剂量增加其抑制作用增强;③不同浓度的瘦蛋白对肝细胞LDLRmRNA表达无剂量依赖性影响。 采用半定量RT-PCR方法,测定了细胞培养液中添加不同浓度的NEFA(0 mmol/L、