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WRKY转录因子,能特异结合植物体内的顺式作用元件而调控下游基因的表达。它是植物中的重要转录因子,不仅参与植物生长发育和代谢调节等过程,还能调控植物对生物和非生物胁迫的响应。当下对于WRKY的深入研究主要在拟南芥和水稻中,而其他植物的相关研究较为有限。本研究以杨柳科杨属优良品种欧美杨(Populus×euramericana)为材料,从中克隆出新的WRKY转录因子,即PeWRKY31基因。对Pe WRKY31基因进行了生物信息学分析、亚细胞定位分析和转录组分析,进一步构建过表达载体转化烟草,对转基因植株进行耐盐性和室内饲虫鉴定,从而初步鉴定该转录因子的功能。主要研究结果如下:
(1)PeWRKY31基因的克隆和生物信息学分析。基于已有转录组测序数据得到PeWRKY31基因的参考序列,以此设计特异性引物,提取欧美杨RNA反转录获得cDNA,命名为PeWRKY31。该基因的ORF区为1842bp,编码613个氨基酸,是一种酸性且不稳定的亲水蛋白,其磷酸化修饰以丝氨酸为主,苏氨酸为辅。将PeWRKY31基因编码的蛋白与其他WRKY蛋白进行同源序列比对,表明PeWRKY31是锌指结构C2H2型第Ⅱ类WRKY转录因子,并对其进行系统进化树分析,显示了与同属植物毛果杨转录因子较近的亲缘关系。
(2)亚细胞定位分析。构建亚细胞定位载体35S:GFP:PeWRKY31瞬时转化烟草,于荧光显微镜下观察。结果显示,对照组35S:GFP的荧光信号在细胞核和细胞质等区域均有分布,并非特异性定位;而处理组35S:GFP:Pe WRKY31特异性定位细胞核。表明PeWRKY31转录因子是核定位蛋白。
(3)过表达PeWRKY31基因载体的构建和烟草的遗传转化。通过传统的酶切连接方法构建过表达载体,并经农杆菌介导转化烟草,利用Kan生根筛选和提取烟草DNA进一步PCR检测获得转基因植株,再进行转录组测序,经KEGG富集分析显示转PeWRKY31基因烟草能富集到多个与耐盐和抗虫相关的重要通路。同时测定移栽温室转基因烟草的生长和生理指标,结果表明转PeWRKY31基因未对植株的生长和生理产生显著性影响。
(4)转PeWRKY31基因烟草的耐盐性分析。以NaCl为盐胁迫因子,盐浓度分别为0‰、4‰、7‰。盐胁迫之后,测定转基因烟草和野生型烟草的生长指标、电导率、叶绿素含量、MDA含量、POD活性和SOD活性,分析对比它们的耐盐性。转PeWRKY31基因和野生型烟草的株高、地径、叶绿素含量均随盐浓度的上升而呈下降趋势,且相同胁迫浓度下的转基因和野生型烟草无明显差异;当盐浓度到达7‰时,转基因烟草的电导率、MDA含量、POD活性和SOD活性等生理指标均显著优于野生型烟草,说明PeWRKY31基因的转入能一定程度上提高植物的耐盐能力。
(5)转PeWRKY31基因烟草的抗虫性分析。将同等叶面积的转基因烟草株系和野生型烟草的叶片,分别置于同一培养皿和置于不同培养皿饲养棉铃虫,转基因烟草植株损失的叶面积显著少于野生型,说明转Pe WRKY31基因能提高植物的抗虫性。
(1)PeWRKY31基因的克隆和生物信息学分析。基于已有转录组测序数据得到PeWRKY31基因的参考序列,以此设计特异性引物,提取欧美杨RNA反转录获得cDNA,命名为PeWRKY31。该基因的ORF区为1842bp,编码613个氨基酸,是一种酸性且不稳定的亲水蛋白,其磷酸化修饰以丝氨酸为主,苏氨酸为辅。将PeWRKY31基因编码的蛋白与其他WRKY蛋白进行同源序列比对,表明PeWRKY31是锌指结构C2H2型第Ⅱ类WRKY转录因子,并对其进行系统进化树分析,显示了与同属植物毛果杨转录因子较近的亲缘关系。
(2)亚细胞定位分析。构建亚细胞定位载体35S:GFP:PeWRKY31瞬时转化烟草,于荧光显微镜下观察。结果显示,对照组35S:GFP的荧光信号在细胞核和细胞质等区域均有分布,并非特异性定位;而处理组35S:GFP:Pe WRKY31特异性定位细胞核。表明PeWRKY31转录因子是核定位蛋白。
(3)过表达PeWRKY31基因载体的构建和烟草的遗传转化。通过传统的酶切连接方法构建过表达载体,并经农杆菌介导转化烟草,利用Kan生根筛选和提取烟草DNA进一步PCR检测获得转基因植株,再进行转录组测序,经KEGG富集分析显示转PeWRKY31基因烟草能富集到多个与耐盐和抗虫相关的重要通路。同时测定移栽温室转基因烟草的生长和生理指标,结果表明转PeWRKY31基因未对植株的生长和生理产生显著性影响。
(4)转PeWRKY31基因烟草的耐盐性分析。以NaCl为盐胁迫因子,盐浓度分别为0‰、4‰、7‰。盐胁迫之后,测定转基因烟草和野生型烟草的生长指标、电导率、叶绿素含量、MDA含量、POD活性和SOD活性,分析对比它们的耐盐性。转PeWRKY31基因和野生型烟草的株高、地径、叶绿素含量均随盐浓度的上升而呈下降趋势,且相同胁迫浓度下的转基因和野生型烟草无明显差异;当盐浓度到达7‰时,转基因烟草的电导率、MDA含量、POD活性和SOD活性等生理指标均显著优于野生型烟草,说明PeWRKY31基因的转入能一定程度上提高植物的耐盐能力。
(5)转PeWRKY31基因烟草的抗虫性分析。将同等叶面积的转基因烟草株系和野生型烟草的叶片,分别置于同一培养皿和置于不同培养皿饲养棉铃虫,转基因烟草植株损失的叶面积显著少于野生型,说明转Pe WRKY31基因能提高植物的抗虫性。