论文部分内容阅读
第一部分RECK基因在正常妊娠及妊娠期高血压疾病的表达研究[目的]探讨肿瘤抑制基因RECK (the reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs)在正常早孕、足月妊娠、子痫前期绒毛、胎盘的定位及表达,探讨其与滋养细胞浸润的关系。[方法]分别采用免疫组织化学方法、半定量RT-PCR法、Western blot检测45例正常妊娠组(早期妊娠组22例、足月妊娠组23例)及42例子痫前期患者(22例轻度子痫前期、20例重度子痫前期)绒毛、胎盘中RECK基因的蛋白定位、表达和mRNA、蛋白表达水平。[结果] (1)免疫组化提示正常妊娠组和子痫前期组均有RECK蛋白表达,其主要表达在细胞滋养细胞、合体滋养细胞的胞膜和胞质;RECK在正常早孕的具有侵袭力的固定绒毛的细胞柱上表达呈弱阳性;正常早孕组绒毛RECK阳性细胞的平均吸光值明显低于正常足月妊娠组(P<0.05);轻度子痫前期组、重度子痫前期组RECK蛋白表达均显著高于正常足月妊娠组(分别P<0.05, P<0.01),重度子痫前期RECK平均吸光度比值明显高于轻度子痫前期组(P<0.05); (2)RT-PCR法亦提示正常早孕组绒毛RECKmRNA平均吸光值明显低于正常足月妊娠组(P<0.05),轻度子痫前期组、重度子痫前期组RECK的mRNA水平显著高于正常足月妊娠组(分别P<0.05, P<0.01),重度子痫前期RECKmRNA平均吸光度比值明显高于轻度子痫前期组(P<0.05);(3)Western blot检测亦显示在正常早晚孕胎盘组织均有RECK蛋白表达,妊娠早期RECK蛋白的表达最低(平均光密度值为0.15±0.02),足月妊娠时RECK蛋白表达(平均光密度值为0.68±0.06)显著高于早期妊娠(P<0.05),轻度子痫前期组、重度子痫前期组中RECK蛋白平均吸光度比值明显高于正常足月妊娠组(分别P<0.05,P<0.01),重度子痫前期RECK蛋白平均吸光度比值明显高于轻度子痫前期组(P<0.05)。[结论] (1)在正常妊娠中,RECK基因在胎盘组织中的表达随孕周增长而增加,足月妊娠的RECK表达水平明显高于早孕组,这种变化与正常妊娠早期滋养细胞浸润能力最强,至妊娠晚期几乎无浸润能力的变化相反,提示RECK基因可能参与正常早孕滋养细胞侵蚀的调控;(2)与正常足月妊娠比较,RECK在子痫前期胎盘组织表达更高,在重度子痫前期表达最高,提示该基因异常表达升高可能在子痫前期胎盘浅侵蚀中起重要的作用。第二部分RECK基因表达对绒毛外滋养细胞基质金属蛋白酶-2活化及细胞侵袭力影响的研究[目的]观察RECK基因过表达对体外培养的人早孕绒毛外滋养细胞系TEV-1的MMP-2活化及细胞侵袭力的影响。[方法] (1)以脂质体Lipofectamine? 2000介导的方法将含RECK全长基因的真核重组表达质粒pcDNA3-RECK转染入TEV-1细胞,以获得稳定转染目的基因的TEV-1细胞株。实验分3组,即空白对照组(TEV-1细胞)、空载质粒转染组(稳定转染pcDNA3)、重组质粒转染组(稳定转染pcDNA3-RECK)。根据Invitrogen公司提供的优化转染条件,稳定转染TEV-1细胞株。转染前TEV-1接种5×105 TEV-1细胞于6孔板上,待细胞达到90%融合时,将含3μg质粒DNA的250μl Opti-MEN和含8μl Lipofect-amine的250μl Opti-MEN轻轻混匀.室温孵育20 min,使转染复合物形成,加入培养板中,37孵育,转染后24 h换新鲜培养液培养。对转染pcDNA3和pcDNA3-RECK的细胞用800μg/mlG418加压筛选,并用未转染的细胞作对照,逐渐将G418浓度减至200μg/ml维持筛选,16天后可获得稳定转染的TEV-1细胞,进行RT-PCR和流式细胞术检测目的基因的表达;(2)明胶酶谱法、Matrigel侵袭实验分别检测TEV-1细胞MMP-2活化及细胞侵袭力变化;(3)四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和细胞生长曲线法观察细胞增殖情况。[结果] (1)目的基因在重组质粒转染组TEV-1细胞mRN和蛋白水平分别有独立表达;(2)明胶酶谱结果显示,TEV-1细胞有MMP-2的基础活化,正常对照组与空载质粒转染组的MMP-2活化比例分别为0.43±0.12,0.52±0.14,,二组间差异无显著性意义;重组质粒转染组MMP-2活化比为0.11±0.04,与空载质粒转染组比较明显降低,两者差异有显著性意义(P<0.05),表明RECK基因表达上调可降低MMP-2的活化比例;(3)Matrigel细胞侵袭实验结果显示:正常对照组与空载质粒转染组的穿透Matrigel细胞数分别为273.8±20.5和287.5±22.1,两组间无显著性差异(P>0.05);重组质粒转染组穿透Matrigel的细胞数为140.2±26.6,明显低于空载质粒转染组,两者差异有显著性意义(P<0.01)(见图3)。表明上调RECK基因表达可降低绒毛外滋养细胞侵袭力;(4)MTT法测pcDNA3-RECK转染组细胞生长曲线与正常对照组、空载质粒转染组之细胞比较无明显差异。[结论] RECK过表达可显著减少绒毛外滋养细胞的MMP-2活化及其侵袭能力,而对细胞增值无影响,表明RECK可能参与了早孕绒毛外滋养细胞侵蚀机制。