研究背景溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是炎症性肠病的一种,它是一类与免疫相关且病因未明的肠道炎性疾病,目前认为溃疡性结肠炎的发病与环境、遗传、感染与肠道菌群、免疫等因素相关。关于治疗溃疡性结肠炎的药物有多种类型,例如氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂等。但是这些药物易产生抗药性、药物副作用或价格昂贵,基于其药物副作用小和治疗方法简单等优点,近年来药用植物及其衍生物在治疗UC中的使用越来越受到科学家的关注。植物甾醇是在植物中发现的天然化合物,主要存在于所有植物性食物中富含脂质和富含纤维的组分中。植物甾醇在结构上类似于胆固醇,有与胆固醇相似的结构和生物学功能,对多种疾病,如心脏血管疾病、肝脏疾病和癌症等,具有保护作用。同时植物甾醇对胃肠道炎症也有保护作用。蒲公英甾醇(taraxasterol,TS)是植物甾醇的一种,在蒲公英根中含量较高。目前研究表明,TS具有抗炎活性性,对多种炎性因子,如白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-ɑ(Tumor necrosis factor–alpha,TNF-ɑ)等的表达水平有显著的抑制作用。此外,TS对类风湿关节炎、急性肺损伤和内毒素血症等疾病有保护作用。但是,目前尚且没有关于蒲公英甾醇对于溃疡性结肠炎作用的研究。基于TS与机体炎症的密切关系,我们通过建造小鼠溃疡性结肠炎模型,研究TS对小鼠溃疡性结肠炎的保护作用,并通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肠巨噬细胞研究TS的抗炎机制。第一部分蒲公英甾醇对小鼠溃疡性结肠炎模型的保护作用目的通过建造小鼠溃疡性结肠炎模型,研究蒲公英甾醇对小鼠溃疡性结肠炎的保护作用。方法实验动物为SPF级昆明小鼠,共60只,体重为18±2g,雌雄各半,小鼠采购自北京维通利华实验动物技术有限公司。60只小鼠随机分成6组,分别为空白对照组、模型组、TS低剂量组、TS中剂量组、TS高剂量组和阳性对照组。适应性喂养7天后,除空白对照组小鼠外,其余各组均采用硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulp,DSS)干预为溃疡性结肠炎模型。在模型建立的同时,TS低剂量组、TS中剂量组和TS高剂量组的小鼠每天分别腹腔注射剂量为2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的蒲公英甾醇。模型组小鼠每天腹腔注射40ml/kg的生理盐水。阳性对照组小鼠每天腹腔注射剂量为500mg/kg的柳氮磺吡啶(sulfasalazine,SASP)。干预9天后,禁食禁水12h后处死小鼠。处死小鼠前采用内眦取血的方法取小鼠眼球血。采用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中的白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白介素-6、白介素-10(interleukin 10,IL-10)和肿瘤坏死因子-ɑ的含量。处死小鼠后,取出结肠,测量结肠长度并记录,HE染色制作结肠病理切片,电子显微镜观察结肠病理损伤,双盲法对结肠进行病理学评分。分别采用羟胺法检测结肠匀浆中的超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活力、比色法检测结肠匀浆中的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活力、TBA法检测结肠匀浆中的丙二醛(malondialdehyde,,MDA)含量。TUNEL法检测结肠上皮细胞凋亡情况,western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白在小鼠结肠中的表达水平。结果1.小鼠体重变化:在DSS和TS干预过程中,1至9天内,空白对照组和阳性对照组的小鼠平均体重逐渐上升,模型组、TS低、中、高剂量组小鼠的平均体重逐渐下降。第5、7、9天,各组小鼠的体重差异有统计学意义(P?0.05)。第9天,与空白对照组相比,模型组、TS低、中、高剂量组小鼠的体重显著降低,与模型组相比,TS中、高剂量组和阳性对照组小鼠的体重显著升高(P?0.05)。2.疾病活动指数:1至9天内,空白对照组小鼠的疾病活动指数一直维持在小于0.5的低水平。模型组、TS低、中、高剂量组小鼠的疾病活动指数整体呈上升趋势,但是,TS高剂量组小鼠的疾病活动指数的上升趋势较缓慢。第5、7、9天,各组小鼠的疾病活动指数差异有统计学意义(P?0.05)。第9天,与空白对照组相比,模型组、TS低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠的疾病活动指数显著升高,与模型组相比,TS高剂量组小鼠的疾病活动指数显著降低(P?0.05)。3.结肠长度:各组的结肠长度差异有统计学意义(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组小鼠的结肠长度显著缩短,与模型组相比,TS中、高剂量组和阳性对照组小鼠的结肠长度显著延长(P?0.05)。4.结肠损伤:空白对照组上皮细胞结构完整,无炎细胞浸润。模型组隐窝破坏和隐窝变形、排列紊乱,上皮细胞残留或完全破坏,炎细胞浸润。TS各剂量组的结肠病理损伤有不同程度的恢复。阳性对照组损害程度最轻。5.结肠病理组织学评分:各组的病理组织学评分差异有统计学意义(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组小鼠的结肠病理组织学评分显著升高,与模型组相比,TS中、高剂量组和阳性对照组小鼠的结肠病理组织学评分显著降低(P?0.05)。6.炎性指标:各组小鼠血清中的四个炎性指标IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平均存在显著差异(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高,IL-10水平显著降低。与模型组相比,TS高剂量组和阳性对照组的IL-6水平显著降低,TS中、高剂量组和阳性对照组的IL-10水平显著升高,TNF-α水平显著降低(P?0.05)。TS各剂量组与模型组相比IL-1β水平无显著差异(P>0.05)。7.氧化应激指标:各组小鼠结肠匀浆中三个氧化应激指标SOD、MPO和GSH-Px活力均存在显著差异(P?0.05),MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,模型组和TS各剂量组SOD、GSH-Px活力显著降低,MPO活力显著升高。与模型组相比,TS中、高剂量组和阳性对照组的SOD活力显著升高,TS各剂量组和阳性对照组的MPO活力均显著降低,TS高剂量组和阳性对照组的GSH-Px活力显著升高(P?0.05)。8.结肠上皮细胞凋亡情况:各组的小鼠结肠上皮细胞凋亡率差异有统计学意义(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组和TS低、中剂量组凋亡率显著升高,与模型组相比,TS中、高剂量组和阳性对照组凋亡率显著降低(P?0.05)。9.凋亡相关蛋白:各组小鼠结肠中的Bax和Bcl-2蛋白相对表达水平差异有统计学意义(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组的Bax蛋白相对表达水平显著升高,Bcl-2蛋白显著降低。与模型组相比,TS中、高剂量组和阳性对照组的Bax蛋白相对表达水平显著降低,Bcl-2蛋白相对表达水平显著升高(P?0.05)。结论TS能够显著改善溃疡性结肠炎小鼠的疾病症状和结肠病理损伤,能够减轻溃疡性结肠炎小鼠的炎症水平和氧化应激水平,能够抑制小鼠结肠上皮细胞凋亡。第二部分蒲公英甾醇的体外抗炎、抗凋亡作用及其机制研究目的在细胞实验中研究TS对小鼠肠巨噬细胞的炎性因子、凋亡情况的影响,同时研究蒲公英甾醇对核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal protein kinases,JNK)信号相关通路的影响,以进一步探究蒲公英甾醇对溃疡性结肠炎保护作用的机制。方法小鼠肠巨噬细胞购买于上海富衡生物科技有限公司。噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)检测TS对肠巨噬细胞的毒性,根据检测结果将细胞分为5组,分别是空白对照组、脂多糖组(LPS 1ug/ml)、TS低剂量组(LPS lug/ml+TS 5ug/ml)、TS中剂量组(LPS lug/ml+TS 10ug/ml)和TS高剂量组(LPS lug/ml+TS15ug/ml)。干预24小时后,ELISA试剂盒检测细胞上清液中TNF-α、IL-6和前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的含量。流式法检测细胞凋亡和细胞周期。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(Bax,Bcl-2和caspase-3)和信号通路相关蛋白(NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制酶(p-IκBα)、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK))。RT-PCR检测信号通路相关因子(NF-κB p65、p38MAPK和JNK)的m RNA相对表达水平。结果1.炎症因子:三个炎性指标(TNF-α、IL-6和PGE2)均存在显著性差异(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组的TNF-α、IL-6和PGE2水平显著升高,与模型组相比,TS高剂量组的TNF-α显著降低,TS中、高剂量组的IL-6和PGE2显著降低(P?0.05)。2.细胞周期和凋亡:各组干预细胞间各阶段细胞的比例存在显著性差异(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组细胞在G0/G1期的比例较高,在S期和M/G2期的比例较低(P?0.05)。与模型组相比,TS各剂量组细胞在G0/G1期的比例较低,在S期和M/G2期的比例较高,但是差异无统计学意义(P>0.05)。各组的凋亡率差异有统计学意义,与空白对照组相比,模型组和TS各剂量组的细胞凋亡率显著升高,与模型组相比,TS高剂量组的细胞凋亡率显著降低(P?0.05)。3.凋亡相关蛋白:三个凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和Caspase-3)均存在显著性差异(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组Bax蛋白的相对表达水平显著升高,Bcl-2和Caspase-3蛋白的相对表达水平显著降低。与模型组相比,TS中、高剂量组Bax蛋白相对表达水平显著降低,Bcl-2蛋白的相对表达水平显著升高,TS中剂量组Caspase-3蛋白的相对表达水平显著升高(P?0.05)。4.NF-κB信号:NF-κB p65蛋白、p-IκBα和NF-κB p65 m RNA均存在显著性差异(P?0.05)。与空白对照组相比,模型组的NF-κB p65蛋白、p-IκBα和NF-κB p65 m RNA均显著升高,与模型组相比,TS中、高剂量组的NF-κB p65蛋白、p-IκBα和NF-κB p65 m RNA均显著降低(P?0.05)。5.MAPK信号:各组的p38MAPK蛋白和p38MAPK m RNA的相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。各组p-p38MAPK蛋白的相对表达水平差异有统计学意义,与空白对照组相比,模型组和TS各剂量组p-p38MAPK蛋白的相对表达水平显著升高,与模型组相比,TS中、高剂量组p-p38MAPK蛋白的相对表达水平显著降低(P?0.05)。6.JNK信号:各组的JNK蛋白和JNK m RNA相对表达水平的差异无统计学意义(P>0.05),p-JNK蛋白的相对表达水平差异有统计学意义,与空白对照组相比,模型组的p-JNK蛋白显著升高(P?0.05),但是与模型组相比,TS各剂量组p-JNK蛋白的相对表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论在LPS诱导的小鼠肠巨噬细胞中,TS能抑制炎症反应、细胞凋亡,且对NF-κB和p38MAPK信号通路有抑制作用,但对JNK信号通路无显著影响。