第一章构建斑马鱼PCOS动物模型研究背景:多囊卵巢综合征(PCOS)是一种妇科内分泌及代谢异常疾病,常发于育龄期女性。临床上,PCOS的特征表现为高雄激素血症(HA)、稀发排卵(OA)、卵巢多囊样改变(PCO)。目前研究PCOS相关疾病的大部分动物模型为小鼠,大鼠,家兔,恒河猴等。其中,小鼠及大鼠应用广泛,但生殖周期较长,无法进行大批量生育实验,与恒河猴相比没有体现出更好的优势。家兔模型对性激素不是特别敏感,在一定程度上限制PCOS内分泌相关研究。恒河猴虽然与人类卵巢等结构功能极其相似,但相对来说生殖周期过长,价格昂贵,因此不适合进行基础科研。以上模型各有利弊,现有的模型动物均不能完全模拟PCOS的特征,因此根据实验设计进行动物模型选择至关重要。斑马鱼与人类基因的同源性高度相似,而且具有性成熟周期短、体外受精和发育、胚胎透明的特点。作为模式动物,斑马鱼已广泛应用于人体的免疫系统、神经系统和生殖系统疾病的研究中。目前以斑马鱼为动物模型进行PCOS的研究相对欠缺,但是斑马鱼的体外受精等特点在生殖方面的研究优势很大,很多学者利用其上述特点进行生育力等研究,使斑马鱼成为研究生殖领域的很好的动物模型。研究目的:构建斑马鱼PCOS模型,以期进行PCOS易感基因的作用机制等遗传学研究及生育行为相关实验。研究方法:以相应浓度的睾酮浸泡成年(5-10月龄)斑马鱼,取卵巢及精巢行高效液相色谱法(HPLC)检测睾酮浓度;进行卵巢取材,然后经过固定,脱水,包埋,HE染色等观察卵巢形态学变化;检测睾酮处理后排卵率(OR),排卵数(ON),孵化率(HR)的变化;检测对照组与睾酮处理组斑马鱼性腺指数(GSI)的差异。结果:卵巢睾酮含量随不同的处理浓度呈剂量依赖性升高。与正常对照组比较,睾酮处理组HE染色结果显示:卵巢成熟卵泡相对较少(P<0.01),不成熟卵泡所占总卵泡的比例增多(P<0.01),卵巢内卵泡总数增多(P<0.01)。睾酮处理后排卵率比正常对照组显著下降(P<0.01),排卵数降低(P<0.01),孵化率降低(P<0.05),性腺指数显著升高(P<0.01)。结论:睾酮处理后模拟了PCOS的雄激素升高,卵巢多囊样表现,稀发排卵等生育力下降的问题,且胚胎质量下降,卵巢生育潜能增加,部分符合PCOS的特征,因此我们认为已经成功建立PCOS生育相关模型。第二章易感基因在斑马鱼模型中的表达研究背景:目前关于PCOS的病因研究主要分为以下几点:遗传学因素,环境因素,生活方式以及社会-心理因素等。尽管PCOS的发病机制尚未完全阐明,但大部分研究仍把遗传因素认为是PCOS的主要发病机制之一。有学者通过全基因组关联分析(GWAS)方法,发现并确认 TOX3,LHCGR,FSHR,DENND1A,HMGA2,YAP1,INSR,SERBP1,RAB5B,SIRT1,THADA,ERBB3,SUMO1P1,SUOX等十几个PCOS基因易感区域。本研究所涉及的PCOS易感基因为TOX3和DENND1A,研究表明TOX3和DENND1A都与PCOS密切相关,但是由于这两个基因全敲后各自造成的小鼠胚胎致死的效应,截至目前,并没有得到很好的基因敲除小鼠模型,因此针对TOX3和DENND1A的致病机制研究难以深入进行。基于斑马鱼与人类基因的高度同源,且生命力顽强的特点,本研究关注到斑马鱼,以期以斑马鱼为动物模型进行相关易感基因检测。研究目的:检测易感基因dennd1a、tox3在野生型以及PCOS模型斑马鱼中的表达,为之后构建基因敲除及过表达斑马鱼模型奠定基础。研究方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因的定性表达,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术,检测基因在野生型及PCOS模型斑马鱼中的定量表达。利用胚胎整体原位杂交(WISH)方法,观察基因在斑马鱼胚胎内的定位表达。结果:qRT-PCR结果显示在野生型斑马鱼中,dennd1a、tox3 mRNA的表达水平随着胚胎的发育而增加,且在成鱼的不同器官中均有表达,于神经系统和雄性生殖系统中存在高表达。WISH结果表明该基因早期主要定位于脑及脊髓发挥作用。PCOS模型中dennd1a、tox3 mRNA的表达相对于正常对照组在卵巢(P<0.5)、脑(P<0.5)、眼(P<0.01)中表达降低。与此相反,在同样睾酮处理的雄鱼中,dennd1a、tox3 mRNA的表达相对于正常对照组在精巢(P<0.5)中表达升高。结论:斑马鱼dennd1a、tox3基因在胚胎早期发育中发挥着重要作用,基因高表达尤其发现于中枢神经系统和雄性生殖系统。且在PCOS模型中与对照组的基因表达存在差异,间接说明这两个基因与PCOS高雄激素密切相关。dennd1a、tox3基因表达也存在性二态差异。第三章PCOS斑马鱼生育相关行为的改变及临床指导研究背景:PCOS病人的主要关注点是生育相关问题,目前的研究虽然集中在PCOS的寡排卵等器质性水平,但是没有人关注到PCOS女性是否也同时存在性欲下降等心理因素导致的不孕。为了弄清楚稀发排卵的主要原因是卵巢单纯生理结构的变化,还是也与PCOS患者心理因素有关,我们设计了相关行为学实验。但是目前小鼠、大鼠等常用动物模型在生育相关实验中操作困难,耗时长,且成本高昂,所以不具备研究生育实验的优势。而斑马鱼生命力顽强,性成熟周期短,易于繁育等特点特别适合进行生育力实验。因此,本课题组选用斑马鱼进行交配行为研究。研究目的:检测PCOS的生育力问题的根源是单纯的功能性排卵障碍,还是也与性兴趣下降相关。评估PCOS斑马鱼在不同生活方式下(单雌单居、雌雄混居)对生育行为有无影响。研究方法:行为学实验:构建斑马鱼PCOS模型,录像并分析斑马鱼交配样行为,进行客观评分,评测斑马鱼的性兴趣差异;构建模型后采用单雌单居和雌雄混居的不同生活方式处理,检测两种生活方式对PCOS斑马鱼生育力的恢复差异。生育实验:处理后分别进行排卵率以及孵化率统计,以及GSI水平的计算。结果:与对照组相比,PCOS组雌鱼相对性反应下降,主要表现在游动速度及与雄鱼的相对位置方面(P<0.01)。不同生活方式处理3天、14天、30天、60天后,与雌雄混居鱼相比,单雌单居鱼相对性反应升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。生育力相关指标:在不同生活方式处理下,随着时间的推移,单雌单居及雌雄混居PCOS鱼的孵化率没有显著差异。但是随着不同处理时间的延长,单雌单居与雌雄混居PCOS鱼的交配率逐渐体现出差异。结论:PCOS鱼生育力下降主要不仅与成熟的卵泡数目下降有关,还与斑马鱼的相对性反应下降有关。而且这种性反应下降鱼在单居状态下比混居状态下恢复更好。单雌单居与雌雄混居PCOS鱼的交配率随时间延长逐渐出现差异,说明雌雄混居对PCOS鱼的不良影响一直在加深,提示我们混居状态下可能由于雌鱼雄激素水平进一步升高,因此不利于PCOS的恢复。