第三部分明确hsa-miR-4505对HSPA12B的调控位点目的明确hsa-miR-4505对HSPA12B的调控位点方法构建luciferase (萤火虫荧光素酶)表达载体pGL3-promoter-HSPA12B-3’UTR全长和Hsa-miR-4505结合位点突变的克隆。分别将它们与pRL(海肾荧光素酶)内参质粒以及miR-NC和Hsa-miR-4505共同转染HUVEC中,检测报告基因的荧光,计算荧光比值。结果为了验证hsa-miR-4505是否直接作用HSPA12BmRNA3’UTR上,我们对HumanHSPA12B基因进行了报告基因的检测。我们分别用正常及突变的HSPA12B-3’UTR克隆转染HUVEC,结果发现：正常克隆同hsa-miR-4505 mimic共转后,其荧光比值较NC组低且有统计学差异(p=0.0039),突变克隆与hsa-miR-4505 mimic共转后,其荧光比值较NC组无统计学差异。结论正常克隆同hsa-miR-4505 mimic共转后,其荧光比值较NC组低且有统计学差异,突变克隆与hsa-miR-4505 mimic共转后,其荧光比值较NC组无统计学差异。由此可见,hsa-miR-4505直接作用在human HSPA12B mRNA的3’UTR上。第四部分LPS处理HUVEC时hsa-miR-4505表达改变的机制目的明确LPS处理]HUVEC时,hsa-miR-4505表达改变的机制方法按照细胞传代中所叙述的步骤将细胞平均接种于12孔板中,每孔体积为1 mL,37℃、5%C02的培养箱中培养24 h。当12孔板中细胞融合度达到50%-70%时,加入事先稀释好的NF-κB、JNK、ERK和P-38抑制剂处理(分别为NF-κB Activation inhibitor、SP600125、U0126、SB203580)及对照DMSO处理,根据试剂说明书预处理30min-lh后,用LPS处理。处理后12h换液,继续培养12h后在相应时间点收细胞进行实验。结果在LPS处理0、12、24小时后,收细胞,提取总RNA,用stem-loop法对hsa-miR-4505进行qPCR扩增,发现NF-κB、JNK、ERK和P-38相应的抑制剂处理后,hsa-miR-4505在LPS处理12h后的表达水平较未处理组明显下降(P<0.001)结论用stem-loop法对hsa-miR-4505进行qPCR扩增,发现NF-κB、JNK、ERK和P38抑制剂处理后,hsa-miR-4505在LPS处理后12h的表达较未处理组明显下降。因此NF-κB、JNK、ERK和P-38信号通路对hsa-miR-4505的表达具有调节作用。第五部分Hsa-miR-4505通过下调HSPA12B加重LPS诱导的HUVEC损伤目的明确hsa-miR-4505是否可通过HSPA12B影响LPS诱导的HUVEC损伤方法除了HUVEC对照组(CTR-group)和LPS处理组(LPS-group)外,其余4组分别用hsa-miR-4505 mimic (Mimic-group)、miR-NC (NC-group)、 pIRES2-EGFP-HSPA12B-3flag质粒(HSP-group)、pIRES2-EGFP-3flag质粒(Flag-group)分别转染HUVEC,然后用LPS刺激这4组HUVEC,刺激24h后,用MERSST电阻抗检测仪测量各组的TEER(电阻坑)。分别在Mimic-group和NC-group中,用流式细胞术检测HUVEC的ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和VE-cadherin表达水平,划痕试验检测HUVEC修复功能。结果各组TEER值如下对照组(CTR-group)为31±1Ω,LPS处理组(LPS-group)为13±1Ω,hsa-miR-4505 mimic转染组(Mimic-group)为24±2Ω,miRNA-NC转染组(NC-group)为42±3Ω,pIRES2-EGFP-HSPA12B-3flag转染组(HSP-group)为43±3Ω, pIRES2-EGFP-3flag转染组(Flag-group)为25+2Ω。LPS处理组与对照组比较,TEER有显著降低(P<0.001):hsa-miR-4505 mimic转染组与miRNA-NC转染组比较,TEER有显著降低(P<0.001)；pIRES2-EGFP-HSPA12B-3flag转染组与pIRES2-EGFP-3flag转染组比较,TEER有显著升高(P<0.001)。流式细胞术检测发现：与miRNA-NC转染组(NC-group)相比较,VCAM-1和E-selectin在hsa-miR-4505 mimic转染组的表达下降(P<0.05)。划痕试验检测结果发现：与miRNA-NC转染组(NC-group)相比较,]HUVEC的迁移面积在hsa-miR-4505mimic转染组 (Mimic-group)明显下降。结论hsa-miR-4505可以通过降低HSPA12B的表达,从而使HUVEC屏障功能损伤加重(TEER减少、VE-cadherin分子表达下调、HUVEC修复的距离明显下降)。此外,Hsa-miR-4505可以降低内皮细胞表面蛋白分子VCAM-1和E-selectin的表达。脓毒症及其并发症仍是临床上难以解决的问题。肺损伤是脓毒症常见的并发症之一。目前,临床上针对脓毒症肺损伤大多采取支持治疗,缺乏有效的针对其病理生理机制的治疗手段。因此,对脓毒症肺损伤,尤其对其早期诊断和治疗的相关研究仍十分必要。肺微血管内皮细胞(pulmonary micro-vascular endothelial cells, PMVECs)是组成肺血屏障的重要成分之一,在肺组织的营养物质和代谢产物的运输,炎症反应及血压调节等方面起着重要作用。大量研究表明：脓毒症肺损伤时PMVEC被破坏,导致肺血屏障通透性增加；同时部分病原微生物及其代谢产物激活PMVEC,进而激活凝血系统和炎症反应系统。因此,维护PMVEC的功能对减轻脓毒症肺损伤至关重要。HSPA12B是热休克蛋白70家族的成员之一。与其它70家族成员的广泛表达不同,其主要表达在血管内皮细胞中,尤其在肺、脑及肾脏中表达较多。有研究表明：HSPA12B在脓毒症时起着抵抗血管内皮细胞损伤的作用。我们研究发现：HSPA12B在脓毒症患者外周血浆中的含量较正常患者明显升高,并且可能对内毒素刺激的小鼠肺微血管内皮细胞具有一定保护作用,作用机制可能与p38磷酸化抑制有关。因此,HSPA12B有可能成为脓毒症血管内皮损伤的新治疗靶点。如果内源性HSPA12B表达增加,则有可能减轻脓毒症肺损伤。因此,有必要对HSPA12B基因表达的调控因素进行研究。目前HSPA12B基因表达机制并不清楚。有研究认为：转录后调控机制可能参与到了HSPA12B的基因表达调控,但是具体机制并未阐明。常见的转录后调控方式包括RNA前体的加工、内含子的剪接、交替剪接和RNA编辑等内容。miRN A是mRNA转录后调控方式之一。双链miRNA双螺旋结构解旋,其中一条链结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)中,形成非对称RISC,该复合物结合到目标mRNA上起作用。miRNA对靶基因的调控主要是通过对靶基因转录体的切割或对转录体翻译抑制两种机制来实现。这两种机制的选择主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度。但是哪些miRNA在脓毒症中表达发生改变,这些miRNA是否直接作用于HSPA12B的3’UTR并调节HSPA12B基因的表达,及其调节HSPA12B表达后对内皮细胞功能的影响等,尚未见报道。针对上述问题,我们拟进行以下几部分研究。第一部分通过生物信息学手段对可能调节人HSPA12B基因的miR NA进行预测目的预测出对HSPA12B有调节作用的miRNA,以初步确定研究范围方法首先在GenBank--NCBI(核酸序列数据库)中检索人类HSPA12B的mRN A序列,结果发现HSPA12B的mRNA存在着多种剪切体。因此,我们进一步通过Uniprot数据库检索分析并明确何种HSPA12B mRNA的剪切体能够翻译蛋白质。从而选定该条mRNA在targetscan、miRbase和picTar数据库中预测可能作用于HSPA12B的miRNA。根据以上结果,综合分析出可能作用于HSPA12BmRNA的]miRNA。结果发现13条保守的miRNA序列可能作用于人HSPA12BmRNA 3’UTR上,分别为：hsa-miR-3657、hsa-miR-642a、hsa-miR-4505、hsa-miR-3665、hsa-miR-4736、 hsa-miR-940、hsa-miR-4692、hsa-miR-4514、hsa-miR-4742-5p、hsa-miR-4269、 hsa-miR-3664-3p、hsa-miR-4518和hsa-miR-1266,其中hsa-miR-4518和hsa-miR-1266的匹配程度不高,不进行研究。结论Hsa-miR-3657、hsa-miR-642a、hsa-miR-4505、hsa-miR-3665、hsa-miR-4736、 hsa-miR-940、hsa-miR-4692、hsa-miR-4514、hsa-miR-4742-5p、hsa-miR-4269、 hsa-miR-3664-3p这11条miRNA可能作用于人HSPA12B mRNA 3’UTR上,有可能调控人类HSPA12B基因表达,值得进一步研究。第二部分筛选对人HSPA12B基因表达有调节作用的 miRNA目的筛选出对人HSPA12B基因表达有调节作用的miRNA方法合成上述预测的miRNA mimics,用脂质体转染法将这些miRNA转染入HUVEC,使其在HUVEC中高表达,用qRT-PCR和western-blot检测HSPA12B在mRNA和蛋白质水平的表达,另外用qRT-PCR发分别检测上述miRNA,以明确它们的转染效果。结果结果显示,与miRNA-NC组比较,转染miRNA mimics组其相应的miRNA表达明显增加,且HUVEC中miRNA的基础表达极低,可忽略不计。hsa-miR-3657 mimic,hsa-miR-4692 mimic,hsa-miR-4742-5p mimic和hsa-miR-4505 mimic转染HUVEC后,细胞中HSPA12B在mRNA及蛋白质水平的表达均较miRNA-NC组低。hsa-miR-4505,hsa-miR-4514,hsa-miR-3664-3p在LPS处理后12h表达明显升高(P<0.001约是未用LPS处理时的3倍),24h时其表达又下降到基础水平。hsa’-miR-1224-3p,hsa-miR-3127-5p,hsa-miR-3657,hsa-miR-4692,hsa-miR-3665在LPS处理后12h表达上调(P<0.001约是未用LPS处理时的1.5倍),24h时其表达又下降到基础水平。结论hsa-miR-4505、hsa-miR-3657、hsa-miR-4692和hsa-miR-4742-5p对HSPA12B基因的表达有调节作用。hsa-miR-4505、hsa-miR-4514和hsa-miR-3664-3p在LPS刺激的HUVEC中表达水平发生改变。结合这两部分的研究,我们认为hsa-miR-4505对LPS刺激的HUVEC中HSPA12B基因的表达有调节作用。因此,脓毒症时hsa-miR-4505可能对人HSPA12B基因有表达调控作用。