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本文从以下几个方面进行论述: 第一部分 D-半乳糖诱导的听皮层拟老化模型的建立 目的:建立大鼠听皮层拟老化模型。 方法:将2月龄雄性SD大鼠随机分为两组:对照组(自然老化组)和D-半乳糖组(拟老化组)。在D-半乳糖组中,颈背部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg/d)8周;对照组给予相同体积的0.9%盐水注射。造模结束后,将对照组和和D-半乳糖组各分为3个年龄亚组:4月龄组,10月龄组和16月龄组。用透射电镜观察细胞结构改变。用TUNEL染色法,观察听皮层细胞凋亡情况。用β-半乳糖苷酶染色法,检测大鼠听皮层细胞衰老情况。 结果:1.在自然老化组中,4月龄和10月龄大鼠听皮层的神经元结构未见明显异常改变;然而,在16月龄的听皮层中,我们观察到不规则的细胞核结构、大量的脂褐素沉着、线粒体肿胀和神经纤维脱髓鞘样变。在D-半乳糖组中,4月龄听皮层中未见明显的超微结构异常改变;然而,10月龄的D-半乳糖组与16月龄自然老化组相比,具有相似的结构异常改变;此外,这些异常改变在16月龄的D-半乳糖组大鼠中更显著。 2.在自然老化组中,听皮层的TUNEL阳性细胞随着年龄增加而增加。与同月龄的自然老化组相比,10月龄和16月龄的D-半乳糖组TUNEL阳性细胞数量明显增加。 3.在自然老化组中,在4月龄中可见少量β-半乳糖苷酶阳性细胞,在10月龄中阳性细胞增多,在16月龄中阳性细胞明显增多。与同月龄自然老化组相比,D-半乳糖组中的β-半乳糖苷酶阳性细胞明显增多。 结论:随着年龄的增长,听皮层的结构逐渐呈退行性改变,衰老和凋亡细胞逐渐增多。D-半乳糖处理加速了细胞的退行性改变和衰老,增加了细胞凋亡。我们用D-半乳糖成功建立了听皮层拟老化模型。 第二部分 探讨核转录因子Nrf2在听皮层早衰中的作用机制 目的:中枢性老年性耳聋是老年人群中最常见的感觉障碍,但其潜在的分子机制尚不清楚。NF-E2相关因子2(Nrf2)是细胞对氧化应激反应的关键转录因子,然而,Nrf2在中枢性老年性耳聋中的作用仍有待阐明。本研究的目的是利用D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老模型,研究中枢性老年性耳聋的发病机制。 方法:用酶标仪检测听皮层丙二醛(MDA)含量。用实时定量PCR检测线粒体DNA常见缺失(common deletion,CD)。用8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)检测DNA的氧化损伤。用免疫荧光检测 Keap1、Nrf2听皮层定位及表达。RT-PCR检测 Nrf2调控的抗氧化基因(NQO1、HO-1、MnSOD)转录水平。Western blot检测Cytochrome c、cleaved caspase3水平。 结果:1.MDA检测显示:在自然老化组中,MDA含量随着年龄的增加而增加,在D-半乳糖组中,增加更为明显;在不同年龄段,D-半乳糖组的MDA含量较自然老化化组增多。 2.实时定量PCR检测线粒体DNA常见缺失(CD)显示:随着年龄的增长,CD的积累逐渐增加;此外,与同龄的自然老化组相比,D-半乳糖组中CD的累积更加明显。 3.8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)检测显示:与同龄的自然老化组相比,D-半乳糖组8-OHdG水平明显增加;16月龄自然老化组及10月龄D-半乳糖组的8-OHdG水平较4月龄明显增加;而16月龄D-半乳糖组的8-OHdG水平增加更为明显。 4.western blot检测提示:与同月龄的自然老化组相比,D-半乳糖组听皮层中的cleaved caspase-3和释放入胞质的线粒体细胞色素C增多。 5.免疫荧光检测Keap1提示:在各年龄段中,D-半乳糖组的Keap1水平高于自然老化组;与4个月龄组相比,16个月龄组Keap1水平明显增加。 6.免疫荧光检测Nrf2提示:与同月龄的自然老化组相比,10月龄和16月龄D-半乳糖中核内Nrf2水平降低。此外,与4月龄组相比,16月龄组的Nrf2水平显著降低。 7.RT-PCR检测显示:在自然老化组中,16月龄NQO1,HO-1和MnSOD的mRNA水平低于4月龄组。在D-半乳糖组中,16月龄NQO1,HO-1和MnSOD的转录水平较4月龄显著降低。 结论:老化的听皮层中的Nrf2信号活性下降,Nrf2介导抗氧化基因表达下调,听皮层中抗氧化应激能力减弱,导致细胞氧化应激增强,使线粒体DNA氧化损伤增多、线粒体功能障碍,最终导致细胞退行性改变、细胞衰老、凋亡增多,这些异常改变可能与中枢性老年性耳聋的发生密切相关。 第三部分 Nrf2激活剂Oltipraz延缓细胞衰老的作用及机制 目的:探讨Nrf2在延缓细胞衰老过程中的作用及机制 方法:用D-半乳糖诱导细胞衰老。用Nrf2激动剂Oltipraz和D-半乳糖处理PC12细胞后,检测8-OHdG、线粒体DNA常见缺失(CD)、活性氧、线粒体功能、凋亡及衰老情况。实时定量PCR检测CD。用8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)检测DNA的氧化损伤。Western blot检测Cytochrome c、cleaved caspase3水平。DCFH-DA染色检测细胞活性氧。JC-1染色检测线粒体膜电位。Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。透射电镜检测细胞超级结构变化。 结果:1.用D-半乳糖(15 mg/ml)建立了细胞早衰模型。 2.Oltipraz通过激活 Nrf2调控的抗氧化基因(NQO1、HO-1、MnSOD)增加了细胞抗氧化活性。 3.Oltipraz减轻了D-半乳糖诱导的线粒体DNA氧化损伤、线粒体功能异常。 4.Oltipraz减轻了D半乳糖导致的细胞结构改变和细胞凋亡,延缓了细胞的衰老。 结论:Oltipraz通过激活Nrf2通路,减轻了细胞氧化应激水平,减轻了线粒体DNA氧化损伤,维护了线粒体功能,最终延缓了细胞衰老。