功能磁珠的制备及其在淀粉酶解和抗体纯化方面的应用

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功能化磁性高分子微球(简称功能磁珠)集聚磁性载体功能和分离便利性子一体,在细胞分离、靶向给药、固定化酶、蛋白和核酸的纯化等领域具有极其广泛的应用前景,因而成为当前生物分离研究的热点课题之一。本论文在综述磁珠的制备方法、表面功能化技术和应用的基础上,研究和优化一类包裹Fe3O4的磁珠的合成,再分别在磁珠表面固载糖化酶、Protein A/G等生物亲和配基使磁珠功能化,进而分别研究了这些功能化磁珠在催化淀粉水解和纯化抗体等方面的应用。  首先,以甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸乙二醇酯为单体、AIBN为引发剂,采用细乳液聚合法将Fe3O4粒子分散包裹,得到高分子磁珠。优化合成,最终得到平均粒径为1μm、比表面积为32.13 m2/g、孔径为4.78 nm、磁含量为24%和磁饱和强度为25.4 emu/g的磁珠;将其浸泡在1 mol/L HCl溶液中20 h,平均铁渗出值仅为0.10 mg/g,说明其具有良好的耐酸性能。  然后,对第二章制备得到的高分子磁珠以环氧氯丙烷活化、再接枝氨基,最后通过戊二醛偶联得到表面固载糖化酶的功能化磁珠。研究表明,糖化酶固载量为30.4 mg/g的功能磁珠具有最高的相对酶活,为46.5%;同时,与游离的糖化酶相比,化学固定可大幅提高糖化酶对温度、pH值和变性剂的耐受性。在62℃下孵化150 min,固载糖化酶的磁珠在催化淀粉水解时仍保持68.9%的剩余活性;最佳pH从4.6变为4.0,适用的pH值范围更广;分别采用0.3 mol/L的SDS溶液处理游离酶和固定化糖化酶后,游离酶几近失活,对淀粉水解几乎不具有催化活性,而固定化糖化酶仍能保持41.4%的剩余活性;更为重要的是,随使用次数的增加,固定化糖化酶的剩余活性变化较小,仍能保持较高的剩余活性(83.3%)。  最后,在第二章制各的磁珠表面固载Protein A/G,分别得到固载ProteinA免疫亲和磁珠与固载Protein G免疫亲和磁珠,对比研究了固载ProteinA免疫亲和磁珠、本课题组此前制备的ProteinA硅胶柱和ProteinA琼脂糖柱、GE公司ProteinA免疫亲和柱等对人/兔多克隆抗体、兔单克隆抗体、小鼠单克隆抗体等中抗体纯化情况,得到一些有意义的结果。结果表明,随着IgG初始浓度和孵化时间的增加,固载ProteinA磁珠对IgG的纯化量随而增加,增大到一定程度后基本不变;ProteinA磁珠对人多克隆抗体和兔多克隆抗体的纯化能力显著优于本课题组此前开发的ProteinA硅胶柱和Protein A琼脂糖柱;对NPY兔单克隆抗体的纯化效果相比GE公司ProteinA免疫亲和柱相当;而Protein G磁珠对L010和L017号小鼠单克隆抗体的纯化量要优于GE-Protein G HSpin Trap琼脂糖。
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