柑橘全爪螨(Panonychus citri(Mc Gregor))是一种世界性分布的多食性害螨,可取食包括草本和木本在内的106种寄主植物,但主要危害柑橘类果树。目前对于柑橘全爪螨的防治仍然以化学药剂为主。然而,由于该螨发育历期短、世代重叠、繁殖力强等自身特点,加之田间杀螨剂的不科学使用等客观因素,导致抗药性产生并迅速发展。针对柑橘全爪螨田间抗性水平监测及抗性机理的研究将有助于为有效防控策略的制订提供重要的理论指导。目前对介导昆虫(螨)抗药性的机理研究主要围绕靶标抗性以及代谢抗性两个方面。其中,谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs;EC 2.5.1.18)作为生物体内重要的解毒代谢酶之一,在生物体对内源或外源物质的解毒代谢过程中具有重要作用,而且,GSTs还参与抗氧化胁迫保护。已有研究报道证实,GSTs参与昆虫(螨)对杀虫(螨)剂的解毒代谢,进而介导昆虫(螨)抗性的发生及发展。迄今,关于柑橘全爪螨GSTs的研究相对滞后,对柑橘全爪螨GSTs的功能研究及其介导的抗性机理更是鲜有报道。据此,为全面阐释柑橘全爪螨GSTs介导代谢抗性的分子机理,本学位论文在对柑橘全爪螨重庆地区田间种群抗性水平监测获得相关杀螨剂抗性种群的的基础上,通过分析转录组测序数据,克隆获得柑橘全爪螨GSTs基因的c DNA全长序列,系统分析这些基因的分子生物学信息;利用原核表达系统获得柑橘全爪螨GSTs的重组蛋白并比较分析其酶学特性;采用高效液相色谱(high performance liquid chromatograph,HPLC)技术检测并分析GSTs与杀螨剂之间的相互作用关系;应用RT-q PCR(real time quqntitative-PCR)技术解析GSTs基因在柑橘全爪螨不同发育阶段、药剂胁迫以及不良环境胁迫下的表达模式,预测潜在的生理功能;研究并建立柑橘全爪螨RNAi体系,解析柑橘全爪螨GSTs对杀螨剂的解毒代谢功能;最后,利用高通量测序技术筛选鉴定柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性相关基因,探讨甲氰菊酯在柑橘全爪螨体内的代谢途径。本研究旨在全面解析柑橘全爪螨GSTs的解毒代谢功能及其介导的抗药性机理,为柑橘全爪螨田间抗药性的治理提供科学的理论指导。本学位论文的主要研究结果总结如下:1.柑橘全爪螨田间种群的抗药性监测采用叶片浸渍法于2014年对柑橘全爪螨重庆地区4个种群(万州、奉节、武隆和北碚)对常用杀螨剂的抗药性水平进行监测。结果显示,4个种群对甲氰菊酯均产生了不同程度的抗药性。其中,甲氰菊酯对奉节种群和北碚种群的LC50值相对较高,分别为7.14 mg/L和5.30 mg/L,相对抗性水平达310和230倍;对万州种群的LC50相对较低(1.23 mg/L),相对抗性倍数为53倍;而对武隆种群的LC50值与敏感种群相近,相对抗性倍数仅为4倍。阿维菌素对柑橘全爪螨万州种群的LC50值较高,相对抗性倍数达14倍;哒螨灵对柑橘全爪螨奉节种群的相对抗性为12倍。柑橘全爪螨4个种群对新型杀螨剂丁氟螨酯较为敏感且均未产生抗药性。2.柑橘全爪螨GSTs基因的克隆及序列分析在分析筛选转录组测序数据的基础上,采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)技术克隆获得柑橘全爪螨10个GSTs基因的c DNA全长序列,通过序列同源比对将这10个GSTs基因分别归类为delta(3)、mu(5)、omega(1)和zeta(1)4个家族。分子生物学信息分析结果显示,10个GSTs基因的c DNA全长序列介于822-1289 bp之间,开放阅读框长度范围为645-735 bp,推导的氨基酸序列长度介于217-244个氨基酸残基,所编码蛋白的相对分子量大小范围为23.9-27.7k Da,理论等电点范围为5.18-7.65。序列多重比对结果显示,10个GSTs基因的核苷酸序列同源性范围在33.1-66.4%之间,氨基酸序列同源性范围在10.9-60.8%之间。选取蜱螨亚纲二斑叶螨(Tetranychus urticae)32个GSTs基因和肩突硬蜱(Ixodes scapularis)16个GSTs基因以及昆虫纲家蚕(Bombyx mori)20个GSTs基因作为参考,对柑橘全爪螨10个GSTs基因推导的氨基酸序列采用最大似然法通过MEGA6.0软件构建系统发育树。结果表明,柑橘全爪螨10个GSTs与二斑叶螨GSTs的同源性最高,分别与其相应的4个家族(delta、mu、omega和zeta)的GSTs聚在一起。结合二斑叶螨GSTs基因推导的氨基酸序列的多重比对分析,预测柑橘全爪螨4个家族GSTs的的催化活性位点分别位于Ser11(delta家族)、Tyr33(mu家族)、Cys32(omega家族)和Ser14(zeta家族)。柑橘全爪螨10个GSTs基因序列经分析验证后登录至Gen Bank,基因名称及相应的登录号分别为:Pc GSTm1(JQ069034)、Pc GSTm2(JQ069035)、Pc GSTm3(JX846609)、Pc GSTm4(JX846610)、Pc GSTm5(KT717379)、Pc GSTd1(JQ069033)、Pc GSTd2(JQ069037)、Pc GSTd3(KU904396)、Pc GSTz1(JQ069036)和Pc GSTo1(KU904397)。3.柑橘全爪螨GSTs基因的原核表达及酶学特性分析采用大肠杆菌原核表达系统,诱导并纯化获得柑橘全爪螨10个GSTs基因的重组蛋白,SDS-PAGE及Western blot技术验证结果显示重组蛋白的质量较高。以CDNB(1-chloro-2,4 dinitrobenzene)为底物,对10个GSTs重组蛋白的催化活性进行检测,结果显示,10个GSTs均具有催化CDNB与GSH(glutathione)反应的活性,但活性高低存在差异。其中,Pc GSTm5和Pc GSTd1的催化活性显著高于其余8个GSTs。热稳定性检测结果显示柑橘全爪螨重组GSTs在不高于50℃的条件下均能保持较高的活性,说明重组蛋白的热稳定性较强。最适p H测定结果显示柑橘全爪螨10个GSTs均在p H7.5条件下催化活性最高,表明重组蛋白最适酶促反应环境均为中偏碱性。对重组蛋白的酶促反应动力学参数进行测定,结果表明Pc GSTm3与CDNB的亲和能力最强。以过氧化氢异丙苯为底物进行检测,结果显示柑橘全爪螨10个GSTs重组蛋白有一定的过氧化物酶活性。对重组蛋白离体抑制作用测定结果显示,与特异性抑制剂利尿酸相比较,阿维菌素和甲氰菊酯均不能有效抑制柑橘全爪螨10个GSTs的催化活性。4.柑橘全爪螨GSTs基因的表达模式分析采用RT-q PCR技术,解析柑橘全爪螨10个GSTs基因在不同发育阶段、杀螨剂胁迫以及极端高温胁迫后的表达模式。4.1.柑橘全爪螨GSTs基因在不同发育阶段的表达模式分析柑橘全爪螨10个GSTs基因在4个发育阶段(卵、幼螨、若螨和成螨)均有所表达,但表达水平存在差异。其中,Pc GSTm5和Pc GSTo1在幼螨、若螨和成螨期的表达水平显著高于卵期。然而,Pc GSTm2、Pc GSTm3和Pc GSTd3在4个发育阶段的表达量无显著性差异变化。GSTs基因在不同发育阶段的表达特异性暗示其功能可能具有多样性。4.2.柑橘全爪螨GSTs基因应对杀螨剂胁迫的表达模式分析经不同杀螨剂亚致死浓度胁迫处理后,柑橘全爪螨10个GSTs基因的应激表达模式存在差异。其中,阿维菌素能够诱导Pc GSTm3、Pc GSTm4、Pc GSTm5和Pc GSTd1的m RNA水平显著上调,尤其Pc GSTm5的上调幅度最高。拟除虫菊酯类杀螨剂甲氰菊酯胁迫处理后,Pc GSTm2、Pc GSTm3和Pc GSTd1的表达水平均呈现不同程度上调。然而,柑橘全爪螨GSTs基因对线粒体传递链抑制剂哒螨灵的胁迫响应相对较弱,10个GSTs基因的m RNA表达水平与对照相比均无显著性差异。此外,经寄主植物次生代谢物柠檬醛胁迫处理后,柑橘全爪螨GSTs基因积极响应,在胁迫处理后12 h,Pc GSTm1、Pc GSTm3、Pc GSTm4和Pc GSTd1的相对表达量均显著上调。综合分析,经阿维菌素、甲氰菊酯和柠檬醛胁迫处理后表达水平出现上调的GSTs基因有可能参与对相应药剂的解毒代谢过程。4.3.柑橘全爪螨GSTs基因应对高温胁迫的表达模式分析柑橘全爪螨在41℃高温条件下胁迫处理3 h,其体内多数GSTs基因出现上调表达,其中,Pc GSTd1的表达水平上调幅度最为明显,达对照的30倍。暗示GSTs可能通过其抗氧化功能,避免柑橘全爪螨受到由极端温度引起的氧化胁迫伤害。5.柑橘全爪螨GSTs基因的解毒代谢功能分析5.1.柑橘全爪螨GSTs基因Pc GSTm5对阿维菌素的解毒代谢功能分析采用RT-q PCR技术,分析柑橘全爪螨阿维菌素抗性及敏感品系GSTs基因的表达水平。结果显示,Pc GSTm5在抗性种群表达上调。进一步采用RNAi技术干扰Pc GSTm5的表达,发现Pc GSTm5有效沉默后(沉默效率65%)柑橘全爪螨对阿维菌素的敏感性显著升高,RNAi处理与对照的死亡率分别为55.6%和23.0%,表明Pc GSTm5可能参与柑橘全爪螨对阿维菌素的解毒代谢。但是,采用HPLC进行药剂离体代谢作用分析,结果显示尚无证据表明Pc GSTm5能够直接代谢阿维菌素。综合分析,Pc GSTm5可能参与阿维菌素的解毒代谢,进而介导柑橘全爪螨对阿维菌素的抗药性。5.2.柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性与敏感品系比较转录组分析借助高通量测序技术,对柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性和敏感品系进行转录组测序,并在此基础上通过比较转录组分析,发现抗性和敏感品系间差异表达的基因861个,其中,499个基因在抗性种群表达上调,362个基因在抗性种群表达下调。进一步注释499个上调表达基因的功能,发现上调基因包括解毒代谢酶(P450s、GSTs、Car Es)、热激蛋白、表皮蛋白、ABC转运蛋白以及抗氧化酶基因等,且热激蛋白、表皮蛋白以及抗氧化酶基因的上调倍数相对较高。推测上述基因可能共同参与甲氰菊酯的解毒代谢,据此提出了甲氰菊酯在柑橘全爪螨体内的解毒代谢途径。5.3.柑橘全爪螨GSTs基因Pc GSTd1对甲氰菊酯的解毒代谢功能解析采用RT-q PCR技术,分析柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性及敏感品系GSTs基因的表达水平。结果显示,除Pc GSTm1、Pc GSTd3和Pc GSTo1以外,其余7个GSTs基因均在甲氰菊酯抗性种群过量表达。转录组测序结果同样显示,Pc GSTd1在甲氰菊酯抗性种群过量表达。但是采用HPLC进行药剂离体代谢作用分析,结果显示尚无充分证据表明Pc GSTd1能够直接催化代谢甲氰菊酯。采用RNAi技术有效沉默该基因的表达后,发现Pc GSTd1可能参与调节柑橘全爪螨体内脂质过氧化水平,保护柑橘全爪螨免受由甲氰菊酯引起的氧化胁迫伤害。据此推测,Pc GSTd1可能是柑橘全爪螨对抗甲氰菊酯的充分但非必要因素。综上所述,本学位论文研究在柑橘全爪螨转录组分析筛选的基础上,通过RACE技术克隆获得了10个柑橘全爪螨GSTs基因的c DNA全长序列,详尽分析了序列的分子生物学信息;利用大肠杆菌原核表达系统获得了这些GSTs基因的重组蛋白,并比较分析了酶学特性,发现Pc GSTm5和Pc GSTd1的重组蛋白具有相对较高的催化活性,暗示其在柑橘全爪螨GSTs超基因家族中可能占据重要地位;通过RT-q PCR技术,解析了柑橘全爪螨GSTs基因在不同发育阶段、药剂胁迫以及极端温度胁迫条件下的表达模式,推测相关上调GSTs基因可能参与阿维菌素、甲氰菊酯以及柠檬醛的解毒代谢过程;成功建立了柑橘全爪螨RNAi体系,在此基础上证明Pc GSTm5可能参与柑橘全爪螨对阿维菌素的解毒代谢,进而介导柑橘全爪螨对阿维菌素的抗药性;RT-q PCR以及转录组分析结果均表明,Pc GSTd1的过量表达可能与柑橘全爪螨对甲氰菊酯的抗药性相关;此外,通过比较转录组分析筛选出甲氰菊酯抗性相关基因,探讨并提出包括具有抗氧化功能的Pc GSTd1在内的甲氰菊酯在柑橘全爪螨体内的解毒代谢途径。本研究首次从分子生物学水平对柑橘全爪螨GSTs基因的序列信息、酶学特性、表达模式及其解毒代谢功能进行了较为全面深入地解析。所获得的研究结果及结论,将为柑橘全爪螨田间抗药性的治理以及新型有效防控策略的设计提供坚实的理论基础。