在植物胚胎发生过程中,不同物种胚胎细胞分裂模式多种多样。然而,在大多数陆地植物种中,合子横分裂为顶、基两个细胞却是一种共同的现象。合子通常进行一次不均等分裂形成两个形态、分裂方式及发育命运截然不同的子细胞。一般,体积较小的顶细胞将经横分裂、纵分裂等多种细胞分裂方式,按种属固有的顶细胞系发育途径形成胚胎的主要部分;而体积较大的基细胞则只进行有限几次横分裂,按特定的基细胞系发育途径形成胚柄。胚体和胚柄发育途径在细胞形态和分裂模式上存在着显著差别。因而,明显可见原胚的结构是由胚体和胚柄两个区域构成。胚体最终发育为成熟胚胎,而胚柄细胞在后续胚胎发生过程中通过细胞程序性死亡而消失。来自同一个母细胞合子的两个子细胞的分裂模式、发育途径和发育命运截然不同。哪些关键分子、什么样的分子机制控制着顶、基细胞按不同途径发育一直是发育生物学研究领域的核心问题,多年来备受发育生物学家关注。然而,由于研究的难度很大且缺乏理想的研究切入点,关于顶、基细胞发育途径抉择调控机制的研究目前仍十分缺乏,迄今,对其重要决定因子和其调控机理的了解几近空白。在我们实验室的烟草顶、基文库构建、随机克隆测序、特异表达谱分析以及RT-PCR筛选特异表达基因等前期工作基础上,本研究工作克隆到一个顶细胞系特异表达的基因Nt326,与基细胞系特异表达基因Nt CYS高度同源。当Nt326的表达水平降低时,顶细胞不能按照既定的胚体途径发育,转为类似胚柄途径的发育方式,从而,为探讨顶细胞系发育途径的抉择机制提供了不可多得的切入点。以此为基础,我们系统地研究了Nt326及其上游转录因子与下游靶蛋白在参与胚体/胚柄发育途径抉择过程中的功能,从而揭示了一条调控胚胎细胞发育途径抉择的信号途径。其主要结果简述如下:1.在顶细胞c DNA文库中发现一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因Nt326,它与我们在前期工作中发现的基细胞特异表达并调控胚柄细胞程序性死亡起始的关键基因Nt CYS高度同源。两者的编码区序列相似度高达92%,暗示二者编码的蛋白具有高度相似的生理生化功能。但其启动子序列相似度仅为26%,表明这两个同源基因受到不同的转录机制调控。2.证实了Nt326是一个顶细胞系特异表达的基因。从合子的第一次分裂开始,Nt326特异在顶细胞及胚体中持续表达,而在基细胞及胚柄中没有检测到它的表达。因而,该启动子可作为顶细胞系的可靠标记物。3.揭示了Nt326是顶细胞发育途径抉择的重要调控因子。在Nt326-RNAi株系中,我们发现顶细胞不能按照正常顶细胞发育途径进行分裂并发育为胚体,而是转向基细胞发育途径持续进行横分裂,形成胚柄类似结构,整体原胚呈一列纵向排布的细胞。进而,我们证明Nt326-RNAi胚胎中顶细胞发育命运发生改变,并最终导致胚胎发育停滞,影响种子育性。4.证实了Nt326在体外能抑制半胱氨酸蛋白酶C13家族成员液泡加工酶（VPE）的活性。发现在二细胞原胚中有多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂的底物,我们根据转录组数据分析,筛选出与Nt326表达特征相符合的蛋白酶进行了验证。通过体外酶活抑制实验,我们证实Nt326能有效抑制液泡加工酶Nt VPE1a、Nt VPE1b和Nt VPE2的活力。5.揭示了Nt VPE1a在胚胎发育过程中参与顶细胞发育命运决定。在胚胎中过表达Nt VPE1a,胚胎表现出与Nt326-RNAi相似的表型,即顶细胞系改变发育模式,转向进行基细胞系发育模式,胚胎发生程序无法正常启动。进一步说明了Nt326在体内通过抑制Nt VPE的活性来调控顶细胞发育途径的抉择。6.筛选到胚体特异转录因子Nt YAB2直接调控Nt326的表达。酵母单杂交结果显示,Nt YAB2能与Nt326的启动子直接结合。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得了Ntyab2突变体,在突变体中我们发现Nt326的表达水平明显降低,证实Nt YAB2是Nt326的正向转录调节因子。7.证明了Nt YAB2参与顶细胞发育途径的抉择。在Ntyab2突变体中,胚胎同样出现败育的表型。当缺失Nt YAB2时,顶细胞系发育途径改变。败育的胚胎表现出与Nt326-RNAi相似的表型,即顶细胞系进入基细胞系发育途径,整体胚胎形成类似胚柄的结构。突变体分析实验进一步说明Nt YAB2通过调节Nt326的转录水平来参与顶细胞发育途径的抉择。综上所述,顶细胞系特异表达的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因Nt326是一个控制顶细胞发育途径抉择的关键因子。Nt326的转录水平受到Nt YAB2直接调控,同时Nt326能抑制液泡加工酶Nt VPE1a、Nt VPE1b和Nt VPE2的活性。烟草通过Nt YAB2-Nt326-Nt VPE通路调控顶细胞发育途径的抉择及胚胎发生的启动。该发现对进一步探讨合子不等分裂对顶、基细胞系发育命运的影响及揭示胚胎发生启动的调控机制具有重要意义。