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目的:克隆并表达犬弓首线虫感染期幼虫nmuc-1编码基因,初步研究nmuc-1重组蛋白的抗原性。 方法:制备犬弓首线虫感染期幼虫,提取总RNA,逆转录合成cDNA。根据 GenBank中登录的T.canis幼虫nmuc-1编码基因的核苷酸序列(GenBank:U398015.1)和原核表达质粒pGEX-4T-1多克隆位点、利用 PCRdesign和DNaClub软件设计扩增去信号肽的nmuc-1的引物序列,PCR扩增获得目的基因,插入原核表达质粒 pGEX-4T-1中,重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)。Western Blotting方法鉴定重组nmuc-1蛋白。用ELISA法检测nmuc-1重组蛋白作为诊断抗原的特异性。 结果:成功克隆出nmuc-1基因,其序列包含完整开放阅读框531bp,编码176个氨基酸。推导出的氨基酸序列与GenBank中犬弓首线虫 nmuc-1蛋白的同源性高,一致性达100%。编码了一个去信号肽蛋白,为典型的粘蛋白区域。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒 pGEX-4T-1- nmuc-1构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得包涵体表达,经纯化得高纯度蛋白。Western blot分析结果显示重组融合蛋白为含GST标签的目的蛋白。ELISA结果显示nmuc-1重组蛋白能被感染犬弓首线虫虫卵小鼠的阳性血清和商品化的ELISA犬弓首线虫检测试剂盒中的抗 TES抗体识别,与感染其他种属寄生虫的小鼠、人、或猪的血清无反应。 结论:成功克隆、表达犬弓首线虫感染期幼虫nmuc-1基因,nmuc-1重组蛋白能被感染犬弓首线虫的小鼠阳性血清识别,产生免疫反应。为重组蛋白用于犬弓首线虫的免疫诊断提供了一定依据,为今后免疫学检测中减少种属间交叉反应提供了新的思路。